Dinàmica cel·lular

 

ÍNDEX

1. Metabolisme cel·lular.
	1.1 Alcalinització citoplasmàtica.
	1.2 Regulació de la concentració de Ca2+citoplasmàtic.
	1.3 Metabolisme de fosfatidilinositols fosfat e inositols fosfat.
2. Cicle cel·lular.
	2.1 Introducció.
	2.2 El cicle cel·lular.
		2.2.1 Les fases del cicle cel·lular.
		2.2.2 La maquinària del cicle cel·lular.
		2.2.3 La fase G1 i els senyals extracel·lulars.
		2.2.4 Regulació conjunta de la transició G1/S per les integrines i els receptors dels factors de creixement.
	2.3 Associació funcional entre les integrines i els receptors dels factors de creixement.
	2.4 Cooperació entre les integrines i els receptors dels factors de creixement en la regulació de la ciclina D1.
		2.4.1 Control transcripcional de la ciclina D1.
		-Regulació de l’ERK.
		-Regulació de la JNK.
		-Regulació de la GSK-3β.
		2.4.2 Control traduccional de la ciclina D1.
		2.4.3 Control post-traduccional de la ciclina D1.
	2.5 Les integrines com a reguladores de les CKI p21 i p27.
		2.5.1 La p21.
		2.5.2 La p27.
	2.6 Integrines i diferenciació.
	2.7 Integrines i anoikis.
3. Regulació de la morfologia cel·lular.
	3.1 Significat de la polaritat en la morfologia cel·lular.
	3.2 Polaritat cel·lular relacionada amb la migració.
	3.3 Adhesió a la matriu extracel·lular (MEC) per establir l'eix de polaritat apicobasal en les cèl·lules fixes o epitelials.
	3.4 La polaritat cel·lular en les cèl·lules en migració està regulada per GTPases activades per integrines.
	3.5 La forma cel·lular és el resultat de la interacció de la matriu extracel·lular (MEC) i les integrines, mitjançant vies de senyalització intracel·lular.
4. Migració cel·lular.
	4.1 Expansió lamedipodial.
	4.2 Acoblament anterior de complexes adhesius.
	4.3 Contracció cel·lular.
	4.4 Desacoblament posterior de complexos adhesius.
Bibliografia.

1. METABOLISME CEL·LULAR

1.1 Alcalinització citoplasmàtica

L’alcalinització citoplasmàtica observada després que es produeixi un estímul adhesiu dependent d’integrines, tant si té caràcter agut com crònic, es deu a l’activitat de l’intercanviador antiport Na⁺/H⁺ (NHE). NHE és una família que inclou sis isoformes (NHE1-NHE6) que funcionen promovent un intercanvi electroneutre entre Na⁺ extracel·lular i H⁺ intracel·lular, regulant així tant el pH com el volum cel·lular. NH₁ expressat de manera ubiqua com una proteïna integral de membrana, té un MW d’uns 91 kDa, presenta 12 segments transmembrana amb extrems carboxi- i amino- citoplasmàtics. És activat, de manera alostèrica, per la disminució de pHi, mentre que la seva activitat és regulada per receptors de superfície com RTK,s, aquells acoblats a proteïnes G o integrines, que, a través de diverses vies de senyalització convergeixen en proteïnes que interaccionen amb l’extrem carboxi-terminal de NHE₁.

L’activació i el reclutament d’integrines produïts per l’adhesió a la matriu extracel·lular estimulen NHE₁ promovent el descens de pH en presència de HCO₃^-. Aquesta estimulació es produeix a través de la via RhoA-ROCK (p160 ROCK), la qual finalment, fosforil·la un domini específic (de fosforil·lació) localitzat en l’extrem C-terminal, produint la seva activació.

Una altra de les isoformes, NHE₃, s’expressa en el domini apical de la membrana de cèl·lules epitelials. La seva funció és regulada per paràmetres físics, com el volum cel·lular, i per senyals solubles (p.e. hormona paratiroidea, ésters de forbol, etc) que, després de la seva recepció, activen proteíncinases de las famílies PKA i PKC, facilitant la fosforil·lació de la regió citoplasmàtica de l’intercanviador. Malgrat això, aquesta via reguladora és funcional només quan el citosquelet d’actina està intacte, donat que és dependent de la fosforil·lació de miosina II per ROCK, un efector de Rho A.

Dels diversos mecanismes de regulació, i en relació amb les integrines, val la pena destacar el que se produeix pel complex Ca²⁺/calmodulina, el qual s’uneix a una regió autoinhibidora produint un canvi conformacional que facilita la activació de NHE₁. Així mateix, és important la presència de proteïnes ERM en la membrana de lamelipodis, donat que la interacció directa amb elles (a diferència de NHE₃ que és indirecta a través dels adaptadors NHE-RF1 i NHE-RF2) permet el seu reclutament en aquestes zones actives de la membrana. Finalment els residus de aminoàcids carregats de les nanses citoplasmàtiques de NHE₁, que se troben en posicions iuxtamembrana, són essencials per a la interacció amb PIP₂ la qual facilita una conformació adient per a la seva activació.

De forma paral·lela, com a conseqüència de la seva interacció amb les proteïnes ERM (però no degut a la seva activitat intercanviadora), NHE₁ juga un paper essencial en l’anclatge d’actina F i en la organització del citosquelet cortical, incloent lamelipodis i fibres d’estrès. Aquest paper és tant crític que cèl·lules deficients en NHE₁ mostren severes anormalitats en la organització del citosquelet marginal.

A més, l’activitat intercanviadora de NHE₁ també és important per a la migració cel·lular, donat que la seva inhibició farmacològica bloqueja tant la protrusió del front d’avanç com el desacoblament del citosquelet en la regió oposada. Aquests efectes poden produir-se com a conseqüència del bloqueig dels canvis osmòtics necessaris per a l'entrada d'aigua (deguts tant als ions com a la transició actina G/actina F), així com l'alteració de l'activitat de proteïnes associades a la actina que són sensibles al pH com cofilina, juntament amb la capacitat d'ancoratge de actina ja comentada.

Finalment, l'activitat de l'intercanviador sembla ser necessària per a la proliferació cel·lular, ja que el seu bloqueig obstaculitza el trànsit de la cèl·lula pel punt de control G2/M, a part de participar en els canvis osmòtics que acompanyen a la progressió pel cicle cel·lular. Així mateix, l'activitat de l’intercanviador s'interpreta com un senyal per a la supervivència cel·lular, ja que cèl·lules defectives en el mateix presenten un increment en la taxa de apoptosi (les cèl·lules apoptòtiques són petites i de citoplasma àcid), accelerant la fragmentació del DNA induïda per Fas.

1.2 Regulació de la concentració de Ca²⁺ citoplasmàtic.

L'augment de la concentració de Ca²⁺ intracel·lular després de l'estimulació de diversos receptors de membrana constitueix un procés essencial en el control de l'activitat cel·lular. En les cèl·lules excitables elèctricament, com neurones i fibres musculars, els canals de membrana són dependents de voltatge, mentre que les cèl·lules que manquen d'aquesta propietat expressen canals independents.

Canals de calci

Aquests canals independents de voltatge es distribueixen en tres grups funcionals, com són (i) canals-receptors (p.i. receptor per a N-Metil-D-Aspartat [NMDAR] o el receptor purinèrgic [P2XR]); (ii) canals independents del nivell intern de Ca²⁺ (p.i. el receptor dependent de araquidonat [IARC] o alguns membres de la família de Receptors de Potencials Transitoris [TRP]) i (iii) canals regulats pel nivell intern de Ca²⁺ [I_SOC- ionic current from store operated channel-] (p.e. canals activats per l'alliberament de Ca²⁺ [I_CRAC], canals epitelials de Ca²⁺ [ECAC] o, fins i tot, alguns receptors TRP). L'activitat d'aquests canals de Ca²⁺ situats en la membrana plasmàtica és la que determinarà, en definitiva, la concentració final de Ca²⁺ i la durada del senyal.

Així, de manera que ja és clàssica per a les cèl·lules no excitables elèctricament, la senyalització per Ca²⁺ es divideix en dues fases, responent la primera d'elles a l'alliberament de Ca²⁺ dels magatzems intracel·lular, mentre que la segona correspon a l'entrada de Ca²⁺ provinent de l'espai extracel·lular. La interacció d'un senyal soluble amb receptors associats a proteïnes G produeixen l'activació de PLC i la consegüent hidròlisi del substrat PIP₂ en els productes DAG i IP₃. Aquest estimula l'obertura de canals dependents (IP₃R) que alliberen Ca²⁺ dels magatzems intracel·lulars (fonamentalment ER), el que provoca un augment transitori de la concentració de Ca²⁺ intracel·lular. Després d'un breu període de temps, el Ca²⁺ també entra per la membrana plasmàtica, el que dóna lloc a una elevació sostinguda de la concentració local de Ca²⁺.

S'ha observat en diversos tipus cel·lulars (macròfags, plaquetes, neutròfils, osteoclasts, fibroblasts, cèl·lules epitelials i cèl·lules mare embrionàries) que, després de la seva adhesió mitjançada per integrines, registren un increment de Ca2+ citoplasmàtic. A més, en sentit contrari, existeixen nombroses evidències experimentals que tant l'adhesió com la migració dependents de integrines són regulades, almenys en part, per les concentracions de Ca2+ intracel·lular.

Aquest augment de Ca2+ citoplasmàtic prové fonamentalment de l'espai extracel·lular, encara que, en general, és precedit de l'alliberament transitori del mateix a partir dels compartiments d'emmagatzematge intracel·lulars, amb la col·laboració o no de recursos extracel·lulars. Aquest alliberament es produeix per l'obertura de canals dependents de IP3, generat per l'activitat de la PLCγ1. Aquesta és activada per fosforil·lació després de la seva interacció directa amb FAK, mentre que el seu principal substrat PIP2 és, al seu torn, producte de l'activitat de PIP5K, enzim regulat per RhoA a través dels factors Vav2 i p120RhoGAP. En conclusió, una vegada activades les integrines, la senyalització derivada d'aquesta a través de FAK permet, en últim terme, un increment transitori del Ca2+ intracel·lular. Encara quan s'assumeix que l'origen d'aquest Ca2+ és intracel·lular, s'ha demostrat la presència de les tres isoformes del receptor dependent de IP3 (IP3R-1, IP3R-2, IP3R-3) en la membrana plasmàtica de diversos tipus cel·lulars. D'aquesta manera, els magatzems extracel·lulars del catió poden contribuir també a l'augment ràpid i transitori de la concentració intracel·lular de Ca2+. Un cop esgotades les reserves intracel·lulars, s'obren els canals de membrana dependents dels nivells interns de Ca2+ (I CRAC, ECAC, Trp) per mecanismes poc coneguts de moment. Aquest influx catiónic és el que produeix un augment local sostingut en la concentració intracel·lular que, en definitiva, és el que posseeix rellevància fisiològica (activació de proteases, regulació de cinases, regulació del citosquelet, control de l’apoptosi, diferenciació, proliferació, migració i adhesió, etc).

De tots aquests efectes fisiològics cel·lulars, és de particular interès el paper que juga la concentració de Ca2+ intracel·lular en la senyalització centrífuga (“inside-out”) a través de la regulació de l'afinitat de les integrines. Referent a això, es pot assenyalar l'existència de diverses proteïnes que uneixen Ca2+ i que, al temps, tenen capacitat d'interaccionar amb determinades conformacions de les regions citoplasmàtiques de les integrines, com calreticulina (existeix, aparentment una forma integral de membrana, ectocalreticulina), calcineurina, calmodulina i CIB. D'aquestes interaccions se succeeix la regulació de l'afinitat de les integrines pels seus substrats. Així, per exemple, calreticulina, una vegada ocupats els dos llocs d'unió per a Ca2+ que disposa, interacciona amb integrines (per exemple, les subunitats α2 i α7) estabilitzant la conformació d'alta afinitat, afavorint, a més, l'entrada de Ca2+ extracel·lular.

Un altre dels efectes fisiològics de l'augment de Ca2+ intracel·lular és la recuperació dels magatzems intracel·lulars del catió, efecte que és dependent de citosquelet i les GTPases Ras i Arf.

En els tipus cel·lulars excitables (fonamentalment fibres musculars i neurones) l'entrada de Ca2+ extracel·lular es produeix per l'obertura de canals de tipus L (dependents de voltatge), que té lloc quan es produeix la despolarització de la membrana plasmàtica. Almenys en neurones, l'augment de Ca²⁺ intracel·lular promou la interacció de Ca²⁺-calmodulina amb l'extrem carboxiterminal del canal, el que desencadena l'activació de la via Ras/MAPK que desemboca en la dels factors de transcripció CREB i MEF_2. Els gens controlats per aquests (c-Fos, BDNF, Bcl-2, entre altres) són essencials per a funcions bàsiques de les neurones com el desenvolupament de dendrites, la supervivència neuronal i la plasticitat sinàptica.

En la fibra muscular llisa vascular també són els canals de tipus L els que tenen major participació en l'entrada de Ca²⁺ en la cèl·lula. No obstant això, i a diferència d'altres models de característiques excitables, els que s'expressen en aquest tipus cel·lular són regulats per integrines. En efecte, s'ha demostrat que l’interacció amb la matriu extracel·lular, especialment la fibronectina, a través de la integrina α₅β₁ promou l'obertura del canal. Aquest fenomen és dependent de la formació de complexos focals, amb la necessària presència de paxilina i vinculina, i d'una activitat tirosíncinasa, presumiblement de Src. Aquesta regulació de la concentració de Ca²⁺ intracel·lular a través de integrines té totes les característiques de mecanisme de mecanotransducció que tindria un paper rellevant en el control del to vascular en situacions de dany, reparació i remodelació tisulars.

1.3 Metabolisme de fosfatidilinositols fosfat i inositols fosfat

Els derivats fosforil·lats de l’inositol, bé en la seva forma integrada en la membrana com fosfatidilsinositols fosfat, bé en les seves formes solubles com inositols fosfat, constitueixen un ampli grup molecular implicat en nombroses vies de regulació cel·lular. El precursor de totes elles, fosfatidilinositol (PI), constitueix menys del 10% del total de lípids de membrana, sent sintetitzat en la cara citoplasmàtica de la membrana del reticle endoplasmàtic.

Fosfatidilinositols (PI,s) i inositolfosfats (IP,s). Regulació de la seva síntesi (I)

Fosfatidilinositols (PI,s) i inositolfosfats (IP,s). Regulació de la seva síntesi (II)

 

L'equilibri entre les activitats de fosfoinositol cinases (que formen part juntament amb les diacilglicerol cinases (DGK) i les esfingosina cinases (SPHK) de les denominades cinases de lípids) i fosfoinositol fosfatases dóna lloc a gairebé trenta metabòlits, la majoria d'ells amb rellevants activitats biològiques. De les fosfoinositol cinases, les quals fosforil·len l'anell de inositol en posició 3 (PI3KI, PI3KII, PI3KIII), 4 (PI4K,s) i 5 (PIPKI, PIPKII, aquesta última exhibint, fonamentalment, una activitat PI4K) són essencials en les rutes transformadores que donen lloc als fosfatidilinositols, associant-se a les cares citosólicas de les membranes de diversos compartiments cel·lulars, incloent la membrana plasmàtica.

L'isoforma PI4K de tipus II (PI4K92, PI4Kβ) s'associa de manera específica amb la integrina α₃β₁ a través de l'intermediari CD151, un membre de la superfamília T4 expressat en leucòcits, línies hematopoiètiques, plaquetes, endotelis i epitelis. Es demostra, en leucòcits, que l'activitat del complex α₃β₁-CD151-PI4K92 regula la migració cel·lular sobre matrius de fibronectina.

Per la seva banda, la isoforma PI4K de tipus III (PI4K230) és activada després de l'adhesió cel·lular a una matriu de vitronectina a través de les integrines αvβ3 i αvβ5. Aquesta activació és dependent de la tirosíncinasa Pyk2 (homòleg de FAK), c-Src i PLC(1. L'activació de PI4K230 dependent d'aquelles integrines participa en la regulació de la reorganització del citosquelet en la migració i polarització cel·lulars.

PIPKI, amb tres isoformes (α, β i γ) que transfereixen un fosfat a la posició 5 de l'anell de inositol de substrats com PI4P, PI, PI3P, PI(3, 4)P₂, és activada directament per les GTPases RhoA, Rac, ARF i el efector ROCK. Aquests activadors enzimàtics exerceixen subsidiàriament la seva funció al reclutar PIPKI a l'entorn de les membranes, de manera que posen en contacte a aquest amb aquells substrats. A més RhoA incrementa l'activitat enzimàtica de PLD, el producte de la qual, l'àcid fosfatídic, exerceix un efecte estimulant sobre PIPKI.

Finalment, s'ha suggerit que PIPK formen, in vivo, complexos de senyalització juntament amb altres PI cinases, que són específics quant a la seva localització intracel·lular, vida i activitat. D'aquesta manera, l'associació amb una PI cinasa específica aportaria un substrat específic, que l'activitat PIPK modificaria donant un producte així mateix específic, fenomen que matisaria en gran manera la falta d'especificitat observada en condicions in vitro.

Factors de regulació de l'activitat dels PI,s

 

L'acció combinada d'ambdós grups d'enzims (PI4K i PIPK) constitueix la principal, encara que no única, via de síntesi de PI(4,5)P₂, fosfoinositol clau, per si mateix i pels seus metabòlits, en la senyalització intracel·lular. També participa en l'organització del citosquelet perifèric de actina, ja que el reclutament de talina depèn de la seva interacció amb PIP₂. De fet després de l'adhesió per integrines hi ha un ràpid descens en la concentració de PIP₂, a causa de l'activació de PLCγ1 a través de FAK, recuperant-se aquella posteriorment pel mecanisme descrit.

L'activitat de les fosfoinositol-3-cinases (PI3K) dóna lloc a metabòlits fosforil·lats en la posició 3 de l'anell, que tan només representen el 0.25% del total de fosfoinositols. Aquesta baixa proporció és indicadora del pes de les funcions reguladores d'aquests metabòlits, enfront de les possibles funcions estructurals. Les diferents classes de PI3K (I, II, III) mostren una organització molecular semblant, ja que tots ells estan constituïts per heterodímers, en els que una subunitat exerceix una funció de regulació, mentre que la una altra reté la funció catalítica. De les tres classes, la I, constituïda per les subclasses PI3K I_A i PI3K I_B, és la millor coneguda i forma part, opcionalment, de qualsevol de les vies de senyalització conegudes. En la subclasse I_A, la subunitat catalítica, p110 (compte amb tres possibles isoformes, α, β i δ) presenta, a part del domini cinasa, un domini d'unió a proteïnes Ras i un domini d'unió a la subunitat adaptadora/reguladora, p85. Aquesta posseeix dos dominis SH2 i un domini SH3 que permeten la interacció amb proteïnes específiques que faciliten la seva localització. Aquestes interaccions regulen l'activitat enzimàtica del heterodímer mitjançant diversos mecanismes, sent essencial la que estableixen amb el substrat. Altre mecanisme d'activació de p85 resulta de l'activitat ser/thr-cinasa que exhibeix la subunitat catalítica, ja que la pròpia subunitat reguladora és activada mitjançant fosforil·lació d'un residu de Ser localitzat entre els dos dominis SH2, i, a més, el receptor de insulina fosforil·lable en residus Tyr (IRS-1) també és substrat de PI3K.

El reclutament de integrines a través dels seus lligands promou la formació de complexos organitzats per proteïnes adaptadoras com FAK, la qual després de la seva fosforil·lació presenta residus de fosfotirosina que són reconeguts per la subunitat p85, procés que acaba amb el reclutament i activació de PI3K en les regions d'adhesió cel·lular, activant així vies de senyalització centrípeta ("outside-in"). Per altra banda, les integrines de la família β2, expressades en cèl·lules circulants, són activades mitjançant interacció amb la proteïna associada citohesina-1, la qual és reclutada a la membrana a conseqüència de l'activitat de PI3K, demostrant així la participació d'aquest enzim en vies de senyalització centrífuga ("inside-out").

L'activitat enzimàtica de les PI3K pot donar lloc a quatre tipus de metabòlits, com són els monofosforil·lats (PI3P), els difosforil·lats (PI(3,4)P₂, PI(3,5)P₂) i els trifosforil·lats (PI(3,4,5)P₃).

PI3P

És produït per PI3KIII i es troba de manera constitutiva en les membranes arribant a una massa equivalent al 0.25% del total dels fosfatidilinositols. PI3P és reconegut per un mòdul de 70 aa que conté el motiu FYVE, relacionat estructuralment amb un anell captador de cations Zn²⁺, presentant-lo, fins el moment, 27 proteïnes de mamífers. La majoria d'elles regulen el tràfic de membrana (EEA1, Rabenosina 5, FENS-1, KIA, Hrs), encara que també són reclutades fosfoinositol fosfatases (MTMR3), fosfoinositol cinases (PIKfyve, és una PI3P 5-cinasa), mediadors de la senyalització TGFβ i organitzadors de citosquelet (Fgd,s que són GEF per a Cdc42).

 

PI(3,4)P₂

La principal via de producció pasa per l'activitat de PI3KI i II, arribant a uns nivells del 0.005% del total dels fosfatidilinositols, el que descarta un paper estructural. La seva massa està subjecta a regulació per senyals extracel·lulars com integrines (αIIbβ3 en plaquetes), factors de creixement (PDGF en fibroblasts) o senyals que afecten al sistema defensiu (fMLP en neutròfils).

PI(3,4)P₂ permet el reclutament de les ser/thr proteíncinasa B (Akt/PKB), encara que la seva total activació també depèn de la fosforil·lació de residus de ser i thr per PDK1, una cinasa regulada així mateix per PI3K. En efecte, aquest procés de fosforil·lació és dependent, així mateix, de la presència de PI(3,4)P₂ o, alternativament de PI(3,4,5)P₃, els quals permeten el reclutament de PDK1 en la membrana a través d'un domini PH, encara que la seva activitat no depèn de la interacció amb els fosfoinositols. PDK1, al seu torn, també activa per fosforil·lació les cinases p70^S6-K, PKCε, i PKCζ.

Akt controla la transducció de senyals de supervivència per a la cèl·lula, ja que inactiva per fosforil·lació Bad, un intermediari d'apoptosi. Encara que també deuen existir altres substrats proapoptòtics fosforil·lables per Akt, aquest fosforil·la GSK3 (glicògen sintasa cinasa 3) i PFK (fosfofructocinasa), el que implica a PI3K en la regulació de gluconeogénesi i glicólisi.

 

PI(3,5)P₂

Representa el 0.005% del total de fosfoinositols i la seva producció és dependent de PI3KIII, havent-se relacionat amb la regulació del tràfic vesicular. Els seus nivells varien després d'un xoc osmòtic i no es coneixen proteïnes específiques d'unió a aquest lípid, encara que qualsevol dels dominis PH presenten afinitat pel mateix.

 

PI(3,4,5)P₃

Amb masses equivalents als productes difosforil·lats és produït en resposta a senyals extracel·lulars de maneres dependent i independent de PI3KI, sent defosforil·lat en la posició 3 per la fosfatasa PTEN, un reconegut supresor tumoral, i per la fosfatasa SHIP en posició 5.

A banda d'Akt, PDK1 i PKCε, PI(3,4,5)P₃ recluta nombroses proteïnes a través de dominis PH que també reconeixen PI(4,5)P₂. No obstant això, de manera més específica, recluta Btk (tirosina cinasa de Bruton), sent activada per autofosforil·lació o per l'activitat de Src. Btk és requerida per a l'activació de la via JNK1 a través de senyals intervinguts pel receptor de cèl·lules B (BCR), i la mutació de la qual dóna lloc a la agammaglobulinemia lligada al cromosoma X.

Grp1, reclutada per aquest fosfoinositol, conté un domini homòleg a Sec7 que té una activitat GEF per a Arf1 i Arf5. Així mateix recluta Vav, un GEF per a Rac, Cdc42 i RhoA , Src, p85 (subunitat reguladora de PI3KI), PLCγ i indueix la transferència de GTP a Rac.

PI3K augmenta els nivells de Ca²⁺ citoplasmàtics dels limfòcits B després de la interacció de BCR amb el seu lligant, en un procés intervingut pel reclutament de Btk i PLC? en la membrana a través de PI(3,4,5)P₃. L'activitat de l'enzim controla el tràfic de membrana a través de Grp1 i la seva fusió a través de les proteïnes amb dominis FYVE. PI3K és necessària per a la quimiotaxis i la producció d'ondulacions membranosas dependents de PDGF, participant a més en el control de la migració a través de la reorganització del citosquelet d'actina intervingut per Vav. Finalment, s'ha demostrat la participació de PI3K en la proliferació cel·lular estimulada per factors de creixement i oncogens, probablement a través de l'activació de Akt.

Activitats cel·lulars regulades per PIP,s

 

La concentració dels fosfoinositols lliures PI(3,4)P₂ i, especialment, PI(4,5)P₂ en la membrana és regulat addicionalment per les proteïnes de la família MARCKS (substrat per a proteíncinasa C miristolat i ric en alanina), on el MARCK de 32 kDa presenta una distribució gairebé universal. MARCKS interacciona, mitjançant seqüències d'aminoàcids bàsics, amb els fosfoinositols difosforil·lats, impedint així el reclutament tant de proteïnes associades al citosquelet de actina, com de proteïnes dotades de dominis PH i també en el cas de PI(4,5)P₂, l'accés de PLCγ, PLCβ1 i PLCδ1, bloquejant la seva hidròlisi i, per tant, la producció de inositols fosfat solubles. La interacció de MARCKS amb els fosfoinositols és estimulat per l'acció de fosfatases o concentracions baixes de Ca²⁺ intracitoplasmàtic, mentre que la tornada a la seva condició soluble és afavorit per l'increment de Ca²⁺ intracitoplasmàtic, a través de calmodulina, o l'activitat de PKC. A més, la interacció de MARCKS i diverses isoformes de PKC dóna lloc a la formació de complexos que regulen l'activitat i funcions biològiques d'aquests enzims.

Per la seva banda, els inositols fosfat provenen, fonamentalment, de la metabolizació d'I(1,4,5)P₃. Aquest és un producte format per l'activitat de diverses isoformes de PLC que originen l'hidròlisi de PI(4,5)P₂, donant lloc a I(1,4,5)P₃ i diacilglicerol (DAG). Tal com s'ha comentat anteriorment, I(1,4,5)P₃ regula l'obertura de canals de Ca²⁺ que es troben en diferents localitzacions cel·lulars, promovent un augment de la concentració de Ca²⁺ intracel·lular.

Els nivells d'I(1,4,5)P₃ són regulats tant per una 5-fosfatasa com per l'activitat d'I(1,4,5)P₃-3 cinasa, la qual és estimulada pel complex Ca²⁺-calmodulina. El producte d'aquesta cinasa, I(1,3,4,5)P₄, sinergiza, aparentment, amb I(1,4,5)P₃ per algun dels canals de Ca²⁺, incrementant la concentració intracel·lular del catió. A més, I(1,3,4,5)P₄ actua com lligant de dos membres de la família GAP1, GAP1^IP4BP i GAP1^m, els quals estimulen l'activitat GTPasa d'algunes proteïnes Ras, com R-Ras i Rap1a. Aquesta interacció amb I(1,3,4,5)P4, regula tant l'activitat d'aquestes proteïnes de la família Ras, com la seva localització intracel·lular.

I(3,4,5,6)P₄ produït per l'acció de cinases i fosfatases específiques posseeix un efecte inhibidor directe sobre els canals de Cl^- activats per Ca²⁺ o CaMKII.

Per la seva banda, IP₆ (àcid fític), el major dipòsit de fosfat en les llavors, és un inhibidor de PKC, interacciona amb diverses proteïnes implicades en la secreció o reciclatge vesicular (sinaptotagmina, AP-2, AP-180, arrestina), estimula l'activitat proteíncinasa citoplasmàtica, afavoreix l'exportació nuclear de mRNA en llevats i activa una proteíncinasa dependent de DNA. Finalment les formes IP₇ i IP₈, produïdes per pirofosforil·lació de IP₆, s'intercanvien fisiològicament amb aquest últim.

 

2. EL CICLE CEL·LULAR

2.1 INTRODUCCIÓ

En els organismes pluricel·lulars, l’homeòstasi tissular és el resultat de l’equilibri dinàmic entre els processos de proliferació, diferenciació i mort cel·lular. Atesa la transcendència que tenen, aquests processos cel·lulars estan regulats estretament per una gran varietat d’estímuls extracel·lulars. Entre aquests estímuls, l’adhesió a la matriu extracel·lular mitjançant les integrines, juntament amb els factors de creixement i de diferenciació, constitueixen els senyals externs més influents. En aquest capítol s’incideix en els mecanismes mitjançant els quals la senyalització associada a l’adhesió per integrines controla el cicle cel·lular i regula, per tant, la proliferació, la diferenciació i l’apoptosi.

 

2.2 EL CICLE CEL·lULAR

2.2.1 Les fases del cicle cel·lular

El cicle cel·lular dels eucariotes superiors consta de quatre fases successives clarament diferenciades: G₁, S, G₂ i M. La replicació del DNA té lloc a la fase S, mentre que la separació de les cromàtides germanes (mitosi) i la divisió citoplasmàtica (citocinesi) ocorren a la fase M. Les altres dues etapes, la fase G₁ (interval entre les fases M i S) i la fase G₂ (interval entre les fases S i M), distancien en el temps la replicació del genoma de la seva segregació. És a la fase G₁ on la cèl·lula integra els diferents senyals extracel·lulars i dóna com a resposta la continuació (proliferació), la detenció temporal (quiescència) o l’abandonament definitiu (diferenciació terminal) del cicle cel·lular.

Las fases del cicle cel·lular

 

2.2.2 La maquinària del cicle cel·lular

La progressió al llarg de les diferents fases del cicle cel·lular està regulada per una família de proteïna-cinases evolutivament conservades, denominades cinases dependents de la ciclina (CDK). Si bé en llevats només una CDK (la cdc2 en el llevat de fissió Schizosaccharomyces pombe i la cdc28 en el llevat de gemmació Saccharomyces cerevisiae) controla les diferents transicions del cicle cel·lular, en mamífers, nombroses CDK de les onze que s’han identificat fins ara (CDK 1-11) desenvolupen aquesta funció. A conseqüència del paper clau que tenen, l’activitat de les CDK està regulada per una multitud de mecanismes. Així, com a primera etapa del procés d’activació, les CDK han d’unir-se a les seves subunitats reguladores positives, les ciclines, de les quals ja se n’han identificat més de deu en mamífers (ciclines A-L i T). Cada ciclina té un patró d’expressió característic i l’abundància és un dels factors determinants en el control de les diferents transicions del cicle cel·lular.

Si bé la síntesi de cada ciclina determina el moment precís d’activació de la CDK corresponent, diferents modificacions posttraduccionals poden modular l’activitat dels complexos CDK-ciclina. En efecte, s’han caracteritzat cinases (CAK) i fosfatases (família de la cdc25) que contribueixen a l’activació dels complexos CDK-ciclina, així com altres cinases (Wee1 i Myt1) que els poden inhibir. A més de la regulació per fosforilació, l’activitat dels complexos CDK-ciclina també pot estar modulada mitjançant la unió de proteïnes reguladores, que solen inhibir l’activitat catalítica de les CDK i reben, per aquest motiu, la denominació de proteïnes inhibidores de CDK (CKI). En mamífers, s’han descrit dues grans famílies de CKI, la família INK4 (= família de la p16) i la família Cip/Kip (= família de la p21), que difereixen en l’estructura i l’especificitat. Tant els membres de la família INK4, com ara la p15, la p16 i la p18, com els de la família Cip/Kip, com ara la p21, la p27 i la p57, poden arribar a aturar la progressió del cicle cel·lular en inhibir complexos CDK-ciclina imprescindibles perquè tinguin lloc diferents transicions del cicle cel·lular.

Regulació dels complexos CDK-ciclina

 

2.2.3 La fase G1 i els senyals extracel·lulars

En mamífers, la influència dels senyals extracel·lulars en la regulació del cicle cel·lular queda restringida a la fase G₁. Una vegada la cèl·lula ha superat l’anomenat punt de restricció (R) a les postremes de G₁, es torna refractària als diferents senyals extracel·lulars i progressa per les diferents fases del cicle amb independència dels senyals externs. Tant és així que, passat el punt de restricció, ni la presència de factors antiproliferatius, com ara el factor de creixement transformant β (TGF-β), pot impedir la compleció d’un cicle mitòtic sencer. Superat el punt de restricció, només els senyals intracel·lulars originats com a conseqüència d’una situació d’estrès cel·lular com ara el dany en el DNA o les deficiències en la formació del fus mitòtic, podrien modificar la progressió del cicle cel·lular.

La progressió al llarg de la fase G₁ i de la transició G₁/S posterior és el resultat de l’activació seqüencial dels complexos CDK4/6-ciclina D1 i CDK2-ciclina E, que tenen com a substrat la proteïna del retinoblastoma (pRb). En l’estat hipofosforilat, la pRb s’uneix a membres de la família de factors de transcripció E2F i, així, reprimeix la transcripció de gens el producte dels quals és clau tant per a la progressió del cicle cel·lular, com ara la ciclina E i la ciclina A, com per a la replicació del DNA, incloent-hi el complex de reconeixement de l’origen de replicació. La fosforilació de la pRb, catalitzada inicialment pels complexos CDK4/6-ciclina D1 i posteriorment pel complex CDK2-ciclina E, donarà lloc a la dissociació de l’E2F i a l’entrada consegüent a la fase S.

Regulació de la proteïna del retinoblastoma

2.2.4 Regulació conjunta de la transició G1/S per les integrines i pels receptors dels factors de creixement.

Per poder proliferar, a més de factors de creixement, la majoria de les cèl·lules dels vertebrats necessiten estar ancorades a la matriu extracel·lular mitjançant les integrines. Tant és així que les cèl·lules no tumorals, quan es cultiven en suspensió, no proliferen. Aparentment, aquesta dependència que la divisió cel·lular té de l’ancoratge assegura als organismes que la proliferació cel·lular queda restringida a aquelles cèl·lules exposades no només als estímuls químics específics (factors de creixement), sinó també a l’entorn físic adequat (matriu extracel·lular). Només la pèrdua del control sobre el cicle cel·lular característic de les cèl·lules canceroses possibilita la proliferació amb independència de l’ancoratge a la matriu extracel·lular.

Les integrines regulen el cicle cel·lular coordinades amb els receptors dels factors de creixement a través de diverses vies de senyalització intracel·lular. Aquestes vies tenen com a característica comuna la convergència i dependència mútua en el control de l’expressió de les ciclines de G₁ i en la regulació de l’activitat de les CDK associades. En efecte, només la senyalització sinèrgica derivada de les integrines i dels receptors dels factors de creixement fa possible l’expressió funcional de la ciclina D1 i la regulació per disminució de les CKI, p21 i p27. Aquests esdeveniments, al seu torn, permetran la fosforilació eficient de la pRb i la progressió consegüent cap a la fase S.

2.3 ASSOCIACIÓ FUNCIONAL ENTRE LES INTEGRINES I ELS RECEPTORS DELS FACTORS DE CREIXEMENT

De vegades, la cooperació entre les integrines i els receptors dels factors de creixement comença pels mateixos receptors. Estudis realitzats in vitro amb diferents tipus cel·lulars mostren que les integrines es poden associar físicament i de manera específica amb determinats receptors proteïna-tirosina-cinasa (RTK), com ara el PDGF-Rβ, l’IR, l’EGF-R, l’ErbB2 i el VEGF-R2. S’ha constatat que aquesta interacció, a més d’estimular l’activació dels RTK fins i tot en absència dels lligands, també en pot incrementar l’eficiència de la senyalització. Actualment, la interacció de la integrina α_vβ₃ amb el PDGF-Rβ i el VEGF-R2 és un dels exemples millor caracteritzats d’aquesta associació funcional. En aquest sentit, s’ha determinat que la interacció entre la integrina α_vβ₃ i aquests RTK es produeix a través del domini extracel·lular de la subunitat β₃ de la integrina. Així mateix, s’ha constatat que en cèl×lules endotelials i fibroblasts cultivats in vitro, aquesta interacció física té un efecte sinèrgic en la senyalització derivada del VEGF-R2 i del PDGF-Rβ, respectivament.

Un altre exemple de sinergia entre les integrines i els receptors dels factors de creixement s’estableix en el recanvi d’aquests últims. Estudis realitzats amb línies cel·lulars primàries de fibroblasts mostren que la pèrdua d’adhesió a la matriu extracel·lular indueix la degradació ràpida del PDGF-Rβ a través de la via ubiquitina-proteosoma, mentre que l’ancoratge d’aquestes cèl×lules a una matriu de fibronectina incrementa el nombre d’aquests receptors ja que n’impedeix la degradació. Si bé encara no es disposa d’informació sobre la universalitat d’aquests sistemes, el conjunt de mecanismes aquí exposats contribueixen a la dependència que la proliferació cel·lular té de l’ancoratge.

 

2.4 COOPERACIÓ ENTRE LES INTEGRINES I ELS RECEPTORS DELS FACTORS DE CREIXEMENT EN LA REGULACIÓ DE LA CICLINA D1

Totes les evidències existents actualment mostren que la combinació dels senyals procedents de les integrines i dels receptors dels factors de creixement regulen l’abundància de la ciclina D1 a través del control de la transcripció, la traducció i el recanvi. Així, només la senyalització conjunta i mantinguda en el temps derivada d’aquests dos tipus de receptors pot fer possible l’expressió eficient de la ciclina D1.

2.4.1 Control transcripcional de la ciclina D1

L’expressió gènica de la ciclina D1 és objecte d’una regulació complexa. Tant és així que en la regió promotora del gen de la ciclina D1 s’han identificat llocs d’unió per a nombrosos factors de transcripció, com ara l’AP-1 (activator protein 1), el CREB (cyclic AMP response element-binding protein), l’Ets-2 (E twenty-six 2), l’NF-κB (nuclear factor kappa B) la β-catenina-TCF/LEF (T cell factor/lymphoid enhancer factor) i l’SP1 (specificity protein 1). Malgrat aquestes troballes, no es disposa, actualment, d’un marc de comprensió que determini l’aportació relativa de cadascun d’aquests elements reguladors en la transcripció final de la ciclina D1. De fet, totes les evidències indiquen que el grau d’implicació d’aquests factors de transcripció varia qualitativament i quantitativament depenent tant del model cel·lular com del tipus d’estímul mitogènic. En qualsevol cas, sembla que l’expressió gènica de la ciclina D1 depèn de l’activació simultània de més d’un d’aquests factors de transcripció i que és, entre d’altres, l’objectiu de la senyalització derivada de les integrines i dels receptors dels factors de creixement. Entre els diferents transductors d’aquesta senyalització, les cinases ERK, JNK i GSK-3β són fonamentalment les que, en últim terme, possibiliten l’activació d’aquests factors de transcripció.

Regulació de l’ERK

La regulació de l’activitat de la MAP-cinasa ERK (extracellular-signal-regulated kinase) constitueix un dels mecanismes fonamentals mitjançant els quals l’adhesió dependent de les integrines controla la transcripció de la ciclina D1. És un fet acceptat que la senyalització associada a les integrines és imprescindible per a l’activació òptima de la cascada Ras-Raf-MEK induïda pels factors de creixement, a través dels receptors proteïna-tirosina-cinasa o dels receptors associats a proteïnes G, i que té el resultat de l’activació de l’ERK. En la majoria de tipus cel·lulars, les integrines regulen aquesta via de transducció de senyals estimulant-ne l’activitat dels components, alhora que controlen el transport nuclear de l’ERK.

 

Activació de la Ras

Les integrines poden induir l’activació de la Ras mitjançant la via FAK-Src, o bé de manera independent de la FAK a través, aparentment, de l’estimulació de la via Fyn-Shc. No obstant això, queda per resoldre quina és la contribució de cadascuna d’aquestes vies en l’activació final de l’ERK.

Activació de la Ras mitjançant la via FAK-Src

Activació de la Ras mitjançant la via Fyn-Shc

     

Activació de la Raf i la MEK

L’estimulació de la Raf i la MEK constitueix l’aportació més determinant de les integrines en l’activació de l’ERK. Diferents experiments realitzats in vitro mostren que, en absència d’adhesió, la senyalització al llarg de la via Ras-Raf-MEK-ERK està totalment o parcialment bloquejada a la Raf i la MEK. Sembla que totes les evidències indiquen que les integrines eliminen aquest bloqueig estimulant l’activitat de la PKC i de la PAK, a través de la PI3K en el primer cas i de la Rac, la cdc42 o l’Nck en el segon. La PKC promou l’activació de la Raf, mentre que la PAK, per la seva banda, pot estimular tant la Raf com la MEK.

Respecte a la PAK, és interessant assenyalar que, a més de la regulació positiva de la Raf i la MEK, també contribueix a l’activació eficient de l’ERK mitjançant la capacitat de controlar el citosquelet perifèric d’actina, la integritat del qual és imprescindible per al manteniment de la cascada Ras/ERK. Així doncs, el conjunt d’aportacions de la PAK és clau per a la dependència que el cicle cel·lular té de l’ancoratge.

Regulació del transport nuclear d’ERK

L’activació de l’ERK té lloc al citoplasma, però per poder desenvolupar la majoria de les seves funcions, com ara induir la transcripció de la ciclina D1, l’ERK ha de ser transportada al nucli. Els mecanismes mitjançant els quals té lloc aquesta importació no es coneixen del tot. L’ERK no conté una seqüència de localització nuclear (NLS) consens i se’n desconeixen els factors importadors, encara que s’ha implicat la GTPasa Ran en la translocació. En qualsevol cas, troballes recents mostren que el transport de l’ERK és dependent tant de la senyalització derivada de les integrines com de la integritat del citosquelet d’actina. En efecte, sota condicions experimentals on s’aconsegueix l’activació forçada de l’ERK en absència d’adhesió, l’ERK no és transportada al nucli, sinó que resta al citoplasma. Es desconeix el mecanisme d’aquesta regulació, però sembla que tot indica que, una vegada s’ha produït l’activació de l’ERK, la senyalització derivada de les integrines continuaria sent necessària per desorganitzar, ara, el complex que l’ERK manté amb diferents proteïnes, com ara la cinasa anterior MEK i les fosfatases MKP-3 (MAP kinase phosphatase 3) i PTP-SL (protein tyrosine phosphatase), que l’ancorarien al citoplasma i n’impedirien el transport.

Regulació del transport nuclear de l'ERK

Una vegada activada, l’ERK pot induir la transcripció de la ciclina D1 en estimular de manera directa o indirecta, a través de cinases efectores, el potencial transcripcional de diversos factors de transcripció, com ara l’Ets-2, l’AP-1 (via c-fos), l’NF-κB, el CREB i l’SP1. Pel que fa a l’Ets-2, l’ERK és la responsable directa de l’activació d’aquest factor de transcripció en fosforilar un residu de treonina localitzat en un dels seus dominis (pointed domain) característics. Respecte a l’AP-1, l’ERK, en fosforilar i activar els factors de transcripció Elk-1 i SAP-1 i la cinasa RSK (p90 ribosomal S6 kinase), pot estimular tant l’abundància com l’activitat de c-fos. Quant a l’NF-κB, l’ERK possibilita l’activació d’aquest factor de transcripció pleotròpic a través també de la cinasa RSK, que té com a diana la proteïna inhibidora de l’NF-κB, la IκBα. La fosforilació de la IκBα n’indueix la degradació per la via ubiquitina-proteosoma, cosa que allibera l’NF-κB de l’ancoratge citoplasmàtic. Pel que fa al CREB, l’ERK pot induir-ne l’activació a través de dues cinases posteriors, com són l’MSK-1 (mitogen‑ and stress‑activated protein kinase‑1) i l’RSK, ja mencionada. Quant a l’SP-1, diversos estudis demostren que l’estimulació de la cascada Ras-Raf-MEK-ERK pot incrementar la capacitat d’unió de l’SP-1 a la regió promotora de la ciclina D1, de manera que n’estimula la transcripció. El cos de coneixements actuals sembla que indica que l’activitat cinasa de l’ERK és la responsable directa d’aquesta regulació. Finalment, cal remarcar que la implicació de tots aquests factors de transcripció en l’expressió gènica de la ciclina D1 pot variar tant qualitativament com quantitativament segons no només el tipus cel·lular, sinó també l’estímul mitogènic.

Regulació transcripcional de la ciclina D per l'ERK

Regulació de la JNK

La senyalització associada a les integrines, a més d’estimular l’ERK, també pot activar la JNK (c-Jun NH₂-terminal kinase), a través de les subunitats α_v i β₁ o de l’heterodímer α₆ i β₄. Aquesta cinasa és l’element final d’una altra cascada de MAP-cinases conservada al llarg de l’evolució, que és activada preferentment per citoquines proinflamatòries, com ara la IL-1 i el TNF, i estímuls ambientals estressants, incloent-hi la radiació ultraviolada i les condicions d’hiperosmolaritat. Amb l’excepció de l’EGF i dels neuropèptids mitogènics, els factors de creixement no indueixen l’estimulació de la JNK. En resposta a l’adhesió per integrines, la JNK promourà l’expressió gènica de la ciclina D1 en regular l’activitat transcripcional de l’AP-1.

Els coneixements actuals evidencien que l’activació de la JNK mitjançant la senyalització derivada de les integrines és un procés dependent de la FAK. Sembla que tot indica que la FAK modula l’activitat de la JNK en estimular la formació dels complexos multiproteics FAK/Cas/Src/Crk, FAX/CAS/Src/Nck i FAK/paxilina/PKL/PIC. Aquests complexos, amb la col·laboració de les GTPases Rac i cdc42, regulen en l’origen la cascada de senyalització que condueix a l’activació final de la JNK. Una vegada activa, JNK és transportada al nucli, on fosforila i activa la c-jun, l’ATF-2 i l’Elk-1 i, d’aquesta manera, regula tant l’activació com l’abundància dels homodímers (c-jun/c-jun, ATF-2/ATF-2) i dels heterodímers (c-jun/c-fos, c-jun/ATF-2) que componen la família de factors de transcripció AP-1.

Regulació de la GSK-3β

Un mecanisme addicional amb el qual les integrines poden controlar la transcripció de la ciclina D1 és regular l’activitat catalítica de la glicogen-sintasa-cinasa-3β (GSK-3β). Aquest enzim, caracteritzat originalment pel seu paper en el metabolisme del glicogen, s’ha revelat com una diana clau de la senyalització derivada de les integrines. En absència de senyalització, la GSK-3β pot fosforilar i regular negativament el potencial transcripcional del CREB, l’AP-1 (via c-jun) i la β-catenina-LEF/TEF, inhibint l’expressió gènica de la ciclina D1 dependent d’aquests factors de transcripció. Mentre que la fosforilació del CREB i l’AP-1 reduirà la capacitat d’unió d’aquests factors de transcripció a la regió promotora del gen de la ciclina D1, la fosforilació de la β-catenina n’induirà la ubiquitinització i degradació conseqüent en els proteosomes.

Diferents estudis demostren que les subunitats β₁ i β₃ de les integrines poden regular negativament l’activitat de la GSK-3β a través de la cinasa ILK, en un mecanisme dependent de la PI3K. L’activitat cinasa de la ILK inhibeix directament o indirectament, a través de l’AKT (també anomenada PKB), la GSK-3β. La inhibició de la GSK-3β dóna com a resultat, d’una banda, l’activació del CREB i l’AP-1 i, de l’altra, l’estabilització de la β-catenina citoplasmàtica. Aquest últim fet possibilitarà l’activació del complex transcripcional format entre la β-catenina i el LEF/TCF. En diversos tipus cel·lulars, la senyalització derivada de la via Wingless (Wnt) també pot contribuir a la transcripció de la ciclina D1 dependent de β-catenina-LEF/TCF en impedir, mitjançant Dishevelled (Dsh), que la GSK-3β fosforili la β-catenina.

 

2.4.2 Control traduccional de la ciclina D1

La traducció de l’mRNA que codifica per a la ciclina D1 és regulada en últim terme per les cinases mTOR (mammalian target of rapamycin) i S6K (p70 S6 kinase). Aparentment, aquestes cinases, en fosforilar la proteïna S6 de la subunitat ribosòmica 40S i el factor inhibidor de la traducció 4E-BP respectivament, possibiliten la traducció d’un determinat grup d’mRNA, entre els quals hi ha el de la ciclina D1. Atesa la seva rellevància fisiològica, l’activitat d’aquestes cinases és objecte d’una regulació estricta. Així, en situacions d’absència d’adhesió, de manca de factors de creixement, de privació nutricional o d’inhibició per contacte, l’mTOR i l’S6K són regulades negativament, de manera que s’impedeix la traducció de la ciclina D1. Les evidències experimentals demostren que les integrines poden regular la maquinària de traducció a través de la cascada de senyalització PI3K-ILK-AKT. La cinasa AKT és la responsable de fosforilar i activar l’mTOR, que fosforilarà tant l’S6K com el 4E-BP, cosa que provocarà l’activació de la primera i la inhibició del segon, i estimularà, així, la traducció de la ciclina D1.

Control traduccional de la ciclina D

 

2.4.3 Control posttraduccional de la ciclina D1

La senyalització derivada de les integrines, a més de regular la transcripció i la traducció de la ciclina D1, també controla l’estabilitat del producte gènic final. En aquest sentit, s’ha demostrat recentment que la GSK-3β és el responsable principal de regular el recanvi de la ciclina D1. La GSK-3β catalitza la fosforilació del residu Thr-286 de la ciclina D1, fosforilació que és el senyal que determina la ubiquitinització i degradació posterior en els proteosomes. Les integrines poden modular aquest procés atenuant l’activitat de la GSK-3β a través, aparentment, de la via PI3K-ILK-AKT. L’activació de l’AKT dóna el resultat d’inhibir la GSK-3β, de manera que s’evita la fosforilació i proteòlisi consegüent de la ciclina D1. Així doncs, la contribució de la via PI3K-ILK-AKT a l’expressió final de la ciclina D1 és doble, ja que en inhibir la GSK-3β, en regula positivament tant la transcripció com l’estabilització.

 

2.5 LES INTEGRINES COM A REGULADORES DE LES CKI p21 I p27

Els coneixements actuals indiquen que la senyalització dependent de les integrines, a més de ser imprescindible per estimular la síntesi de la ciclina D1, també és necessària per regular l’activitat dels membres de la família d’inhibidors de CDK (CKI) Cip/Kip, p21 i p27. Respecte a la p57, el tercer membre d’aquesta família, no hi ha estudis que la relacionin amb la senyalització derivada de les integrines. En qualsevol cas, la p57, a diferència de la p21 i la p27, té un patró d’expressió específic de teixit, que és el reflex de la seva implicació en els processos de diferenciació cel·lular terminal. Tots els membres de la família Cip/Kip es caracteritzen perquè modulen diferencialment l’activitat dels complexos CDK4/6-ciclina D, CDK2-ciclina E i CDK2-ciclina A. Així, la unió als complexos CDK2-ciclina E i CDK2-ciclina A en provoca la inhibició, mentre que sembla que la interacció amb els complexos CDK4/6-ciclina D contribueix a l’engalzament i l’estabilització d’aquests complexos.

2.5.1 La p21

Estudis realitzats in vitro amb diferents models cel·lulars revelen que l’expressió de la p21 durant la fase G₁ és objecte d’una regulació complexa. A l’inici de G₁, en resposta a l’activació de la MAPK ERK, es produeix la síntesi i l’acumulació de la p21, la regulació de la qual té lloc per disminució en l’últim terç d’aquesta fase. L’abundància de p21 a l’inici de G₁ és necessària per a l’activació dels complexos CDK4/6-ciclina D, mentre que la regulació posterior per disminució possibilitarà l’entrada a la fase S, en permetre l’activació dels complexos CDK2-ciclina E i CDK2-ciclina A. Els coneixements actuals indiquen que la senyalització derivada de les integrines és la responsable d’aquesta regulació per disminució ja que reprimeix la transcripció de p21 durant l’últim terç de G₁. Encara que el mecanisme mitjançant el qual les integrines controlen aquest procés és pràcticament desconegut, diverses evidències experimentals revelen que l’activitat cinasa de la Rho és clau en aquesta regulació.

2.5.2 La p27

En absència d’estímuls mitogènics, com ara la manca de factors de creixement o el desancoratge de la matriu extracel·lular, alguns tipus cel·lulars assoleixen un estat de no-proliferació, conegut com a quiescència o fase G₀. L’estudi dels cultius cel·lulars revela que l’activitat de la p27 és determinant per a la inducció i el manteniment d’aquest estat no proliferatiu que caracteritza la quiescència. D’altra banda, aquests estudis també mostren que només la coordinació entre les senyalitzacions derivades de les integrines i dels receptors dels factors de creixement permet el retorn al cicle cel·lular des de la quiescència. En aquesta ocasió, la convergència de senyalitzacions és necessària per induir la degradació de la p27 a través de la via de la ubiquitina-proteosoma en un procés dependent de l’activitat del complex proteic ubiquitina-ligasa-SCF (Skp-cullin-F-box). Durant la quiescència, aquest complex proteic és inactiu, ja que l’expressió d’un dels seus components, concretament la proteïna adaptadora Skp2, està reprimida. La senyalització activada per les integrines és imprescindible perquè tingui lloc la transcripció de l’Skp2, mentre que els senyals derivats dels receptors dels factors de creixement són necessaris per a l’estabilització final d’aquesta proteïna. Malgrat aquests avenços recents, el mecanisme mitjançant el qual les integrines estimulen la transcripció de l’Skp2 és desconegut del tot.

 

 

2.6 INTEGRINES I DIFERENCIACIÓ

La coordinació entre els processos de proliferació i diferenciació cel·lular és responsable de generar la gran varietat de tipus cel·lulars originats durant el desenvolupament embrionari i en determinats teixits de l’organisme adult. De manera semblant a la proliferació cel·lular, la diferenciació cel·lular també està regulada pels senyals procedents del microambient cel·lular. Encara que els factors de diferenciació solubles són els inductors principals d’aquest procés, la diferenciació de molts tipus cel·lulars també és influenciada per la senyalització dependent de les integrines. La majoria de coneixements respecte al paper específic de les integrines en els fenòmens de diferenciació cel·lular provenen dels estudis dels cultius cel·lulars in vitro. D’aquests estudis es dedueix que la diferenciació cel·lular és el resultat de la resposta combinada dels senyals procedents dels receptors dels factors de diferenciació i dels receptors d’adhesió, com ara les integrines. En efecte, per a la gran majoria de tipus cel·lulars, ni la presència de factors de diferenciació ni l’adhesió a la matriu extracel·lular, per si soles, són suficients per estimular els diferents programes d’expressió gènica característics de cada model cel·lular.

En mamífers, un dels exemples millor caracteritzats d’aquesta dependència mútua s’obté en estudiar la inducció de la síntesi de les proteïnes de la llet. Fent servir línies cel·lulars primàries d’epiteli mamari de ratolí es demostra que la interacció de la subunitat β₁ de les integrines amb la laminina és imprescindible per induir l’expressió de la β-caseïna en resposta a l’estimulació de l’hormona lactogènica prolactina. Només la senyalització derivada de la integrina β₁ permet l’activació del receptor de la prolactina i la propagació de la seva senyalització a través de la via JAK2-STAT5.

 

 

2.7 INTEGRINES I ANOIKIS

En determinats tipus cel·lulars, l’ancoratge a les proteïnes de la matriu extracel·lular no és tan sols un requeriment per poder proliferar sinó que també representa una condició imprescindible per a la supervivència. En aquest sentit, nombrosos estudis realitzats tant in vitro com in vivo demostren que les cèl×lules epitelials i les cèl·lules endotelials experimenten, en absència d’adhesió, un procés de mort cel·lular programada. Aquest tipus especialitzat d’apoptosi característic dels models cel·lulars epitelials, se’l denomina anoikis, terme grec que significa ‘sense llar’. Des d’un punt de vista fisiològic, l’anoikis és considerada un mecanisme de control de l’estabilitat dels teixits que impedeix que les cèl·lules que perden el contacte amb la matriu extracel·lular puguin arribar a establir-se en localitzacions inapropiades. Així, l’anoikis ha estat associada amb el desenvolupament i manteniment dels teixits epitelials que tenen un grau elevat de recanvi, com ara la pell i l’epiteli intestinal, i amb la regressió tissular de la glàndula mamària després dels períodes de lactància. D’altra banda, és interessant destacar que també s’ha implicat la supervivència dependent de l’adhesió en els processos de cavitació i de formació de conductes durant el desenvolupament embrionari.

Dels coneixements actuals es deriva que, en els tipus cel·lulars susceptibles, l’anoikis és una via d’activitat constitutiva, és a dir, de funcionament per defecte que només pot ser evitada de manera activa per mitjà dels senyals extracel·lulars. Així doncs, l’existència de l’anoikis implica que les integrines, a través de la seva senyalització, regulen l’activitat de mediadors clau del procés apoptòtic. En aquest sentit, diverses evidències experimentals demostren que la cinasa AKT és el transductor principal d’aquests senyals de supervivència procedents de les integrines. En efecte, l’AKT impedeix l’anoikis en fosforilar i reprimir l’activitat de diverses proteïnes clau per a la inducció de l’apoptosi, com ara la Bad, la caspasa 9 i l’FKHRL-1 (membre de la família de factors de transcripció Forkhead). Recentment, estudis portats a terme en cèl×lules epitelials de la línia MDCK (Madin-Darby canine kidney cells) revelen que la senyalització via integrines evita l’anoikis en controlar de manera simultània no només l’activació de l’AKT, sinó també la degradació. S’arriba a aquesta conclusió en observar que les cèl·lules MDCK mantingudes en suspensió redueixen fins a un 70% els nivells d’AKT per comparació als que es detecten en cèl·lules MDCK ancorades a una matriu de col·lagen. Les evidències experimentals demostren que, com a conseqüència de la manca de senyals procedents de les integrines, membres de la família de receptors implicats en la mort cel·lular s’activen, mitjançant un mecanisme desconegut, i estimulen la caspasa 3, que, en últim terme, escindeix l’AKT.

 

 

3. REGULACIÓ DE LA MORFOLOGIA CEL·LULAR

3.1 Significat de la polaritat en la morfologia cel·lular

En totes les cèl·lules, la distribució dels orgànuls, formacions especialitzades de la membrana i fins i tot inclusions citoplasmàtiques no es dóna de manera uniforme. En relació amb l'activitat funcional de les cèl·lules s'estableix una distribució predominant dels diferents orgànuls i estructures en diferents regions de la cèl·lula. Això origina la polaritat, és a dir, la propietat d'una membrana o d'una cèl·lula de presentar dos o més pols oposats de significació fisiològica i morfològica diferents. Aquesta característica confereix a les cèl·lules la capacitat d'orientar una part de la seva activitat funcional en un sentit determinat.

El concepte de polaritat s'ha de tenir en compte per descriure l'existència d'un o més eixos de simetria a les cèl·lules. A les cèl·lules epitelials la polaritat s'estableix entre les regions apical i basolateral; a les cèl·lules mòbils o migratòries, per l'establiment d'una regió frontal i una de posterior en relació amb la direcció de la migració. En cèl·lules epitelials aïllades (suspensió de cèl·lules), en què no hi ha contactes cèl·lula-cèl·lula ni cèl·lula-matriu, les proteïnes marcadores dels dominis de membrana apical i basolateral no presenten la distribució característica.

3.2 Polaritat cel·lular relacionada amb la migració

La polaritat confereix a les cèl·lules la capacitat d'orientar una part de la seva activitat funcional en un sentit determinat. Tant la polaritat com la migració cel·lular tenen un paper essencial en els processos de desenvolupament embrionari i en processos patològics com ara la cicatrització de ferides, la inflamació i la metàstasi de tumors. L'adhesió a la matriu extracel·lular mediada per integrines és un element crític en la regulació de la velocitat de migració de molts tipus cel·lulars. Tant els fibroblasts com les cèl·lules de carcinomes estableixen una relació entre la velocitat de migració i la concentració de substrat. També s'ha demostrat que els leucòcits neutròfils, que tenen una mobilitat superior als fibroblasts, assoleixen un màxim d'índex de migració en concentracions intermèdies de substrat, en què les cèl·lules formen adhesions a la regió anterior i desfan de mica en mica els contactes en la regió posterior.

Perquè la migració sigui efectiva, les cèl·lules han d'acoblar i desacoblar les integrines amb el citosquelet d'actina en els complexos d'adhesió. Les etapes principals d'aquest acoblament consisteixen en la interacció de proteïnes com ara la α-actinina i la talina a les cues citoplasmàtiques de les integrines, i la incorporació posterior de proteïnes d'unió a l'actina, com són la vinculina i diferents proteïnes reguladores de la polimerització de l'actina. Així doncs, les integrines que formen part d'aquests complexos regulen la migració cel·lular fent funcions d'adhesió, establint interaccions entre la matriu extracel·lular i el citosquelet i duent a terme la funció de transducció de senyals mitjançant membres de la família de proteïnes Rho, que funcionen com a interruptors moleculars de control en la formació de fibres d'estrès, lamel·lipodis i filopodis.

3.3 Adhesió a la matriu extracel·lular (MEC) per establir l'eix de polaritat apicobasal en les cèl·lules fixes o epitelials

En les cèl·lules epitelials, els processos que generen la polaritat cel·lular s'inicien amb l'establiment d'una asimetria morfològica i molecular a la superfície de la cèl·lula, com a resultat de la formació de contactes d'adhesió.

L'eix de polaritat en l'adhesió cel·lular

 

L'adhesió cèl·lula-cèl·lula o cèl·lula-matriu extracel·lular (MEC) provoquen una segregació de proteïnes diferent entre les regions de membrana que estableixen contactes i les que no n'estableixen. Així doncs, l'adhesió cel·lular a la MEC, mediada per la superfamília dels receptors d'adhesió, genera una asimetria estructural i molecular a la membrana, característica de les cèl·lules polaritzades. L'organització d'aquest eix de polaritat apicobasal defineix l'orientació dels dominis apical i basolateral de la membrana, en relació amb els compartiments biològics separats per l'epiteli i, en conseqüència, a la direcció del transport d'ions i de molècules. Un dels factors determinants de l'eix de la polaritat apicobasal és l'orientació i la interacció dels components de la MEC en les diferents regions de la superfície de la cèl·lula epitelial, mediades per les integrines. En estudis fets en cultius de cèl·lules epitelials, aquestes cèl·lules perden la polaritat quan es bloqueja amb anticossos la subunitat β₁ de les integrines, que funcionen com a principals receptors del col·lagen.

En la major part de les cèl·lules, l'agregació de les integrines indueix a l'engalzament d'una xarxa de proteïnes de senyalització que transmeten informació espacial des de les zones de contacte cèl·lula-MEC fins a l'interior de la cèl·lula, mitjançant una sèrie de fosforilacions de diferents proteïnes. Una de les principals proteïnes senyalitzadores és la cinasa d'adhesió focal FAK, una tirosina-cinasa que interacciona amb les integrines, localitzada a les adhesions focals a través d'un domini carboxiterminal d'adhesió focal, que se solapa parcialment amb un motiu d'unió a paxilina. Aquesta cinasa d'adhesió focal serveix per incorporar altres proteïnes senyalitzadores a les zones de contacte (p. e., Src, Fyn i Csk) components de la via MAP-cinases-Ras, així com proteïnes d'unió a GTP (p. e., Rho). Aquests processos de senyalització provoquen l'augment de la contractilitat cel·lular i, juntament amb la unió de les integrines a les proteïnes de la MEC, són necessaris per a la formació d'adhesions focals i canvis en la morfologia cel·lular.

Acoblament entre MEC i integrines per receptors tirosin-cinaces

3.4 La polaritat cel·lular en les cèl·lules en migració està regulada per GTPases activades per integrines

La relació entre el substrat i la polaritat cel·lular implica una regulació dels processos d'adhesió i de formació de protuberàncies de la membrana, mitjançant la via de senyalització de les integrines. De manera específica, els efectes de la concentració del substrat en l'organització del citosquelet i de les adhesions focals implica una via de senyalització mitjançant la família de les GTPases Rho. En cultius de neutròfils s'ha demostrat que, en substrats amb concentracions intermèdies de fibronectina, s'activa la senyalització de Cdc42, Rac1 i RhoA, mediada per integrines, cosa que origina l'establiment de la polaritat cel·lular (P), la formació de protuberàncies i la migració. La Cdc42 i la Rac1 poden estimular la migració activant la formació d'expansions, la polaritat i la formació de complexos focals. La RhoA pot contribuir a la migració estimulant la contractilitat i activant la formació dels contactes d'adhesió necessaris per generar el moviment cel·lular.

Amb concentracions elevades de fibronectina, la senyalització mediada per integrines inhibeix la Cdc42 i la Rac1, però estimula l'activitat de la RhoA, cosa que provoca la pèrdua de polaritat cel·lular i inhibeix la formació de protuberàncies i la migració. Diferents estudis han demostrat abastament l'activació de Cdc42, Rac1 i RhoA per integrines, així com la regulació d'activitat que exerceixen aquestes proteïnes entre elles (vegeu l'apartat 4.2.7).

Cooperació entre les GTPases en la migració cel·lular

En altres tipus cel·lulars s'ha establert el paper de les GTPases Rho (Rho, Rac i Cdc42) en el control de l'organització del citosquelet d'actina. En experiments de microinjecció en fibroblasts, la introducció de proteïna Rho activada provoca l'empaquetament dels filaments d'actina en fibres d'estrès, la introducció de Rac ocasiona la formació de lamel·lipodis i la de Cdc42 ocasiona la formació de filopodis. Alhora, la Cdc42 provoca un senyal de polaritat (P) que garanteix que les protuberàncies provocades per la Rac quedin localitzades en el front d'avenç.

En cèl·lules endotelials humanes, la Rho està implicada en la funció de barrera epitelial, mentre que la Rac intervé en la remodelació del citosquelet provocada per trombina i l'organització del citosquelet d'actina està regulada per una proteïna efectora de les GTPases Rho i Rac, la PRK2. En tots els casos, les estructures d'actina seleccionades per les GTPases Rho s'associen amb agregats d'integrines i d'altres proteïnes en els complexos focals d'adhesió.

En astròcits de rata en cultiu, la migració de les cèl·lules es dóna per un canvi en la polaritat cel·lular, caracteritzat per una orientació direccional de la protrusió i una reorientació del centre organitzador de microtúbuls (MTOC) i del citosquelet microtubular. La inducció dels canvis de polaritat en aquestes cèl·lules s'inicia amb l'activació d'integrines, a la regió frontal de la cèl·lula, cosa que engega la transducció de senyals que provoquen l'activació de Cdc42 i el reclutament i l'activació del complex PKCξ , per establir la polaritat cel·lular.

A més dels efectes en el citosquelet d'actina, les GTPases Rho activades també controlen la proliferació cel·lular i la transcripció gènica a través de les vies de senyalització intracel·lular dependents d'integrines. L'extensió de fibroblasts en un substrat de fibronectina provoca l'activació d'una cinasa (PAK), que és una molècula diana regulada per Rac i Cdc42. A més, la desorganització de l'actina amb citocalasina D o la microinjecció de mutants dominants negatius de la Rac i la Cdc42, inhibeixen l'extensió de la cèl·lula, cosa que demostra que la Rac i la Cdc42 són necessàries. També s'ha demostrat que l'activació de la Cdc42 o la Rac disgrega la morfogènesi de l'epiteli de la glàndula mamària i la diferenciació funcional, processos que estan totalment controlats per integrines.

Regulació de la polaritat per les GTPases Rho en diferents concentracions de substrat

 

3.5 La forma cel·lular és el resultat de la interacció de la matriu extracel·lular (MEC) i les integrines, mitjançant vies de senyalització intracel·lular

Està ben establert que les alteracions en les interaccions MEC-integrines provoquen canvis en la forma i el comportament cel·lulars. Alguns estudis recents han demostrat que els canvis en la forma cel·lular i l'arquitectura tridimensional dels teixits condicionen la funció cel·lular modulant les vies de senyalització d'integrines. Si s'altera la morfologia cel·lular, les cèl·lules poden ser induïdes a proliferar o a entrar en el procés de la mort cel·lular programada.

D'altra banda, la regulació de la polaritat cel·lular a través del substrat, tindria un paper rellevant in vivo, ja que les cèl·lules es troben exposades a diferents ambients extracel·lulars amb concentracions variables dels components de la matriu extracel·lular i dels factors de creixement. Diferents treballs han demostrat que molts tipus cel·lulars, incloent-hi les cèl·lules tumorals, estimulen la migració degradant la matriu extracel·lular en el front d'avenç, mitjançant la secreció de metal·loproteases. La degradació selectiva de la matriu extracel·lular pot reduir la concentració de lligands, de manera que estimulin l'activitat de la Rac1 i de la Cdc42, i activin, així, les expansions de membrana i el moviment cel·lular direccional.

En cèl·lules epitelials de glàndula mamària, les interaccions amb la laminina de la làmina basal a través de la integrina α₆β₄ (necessària per a la formació d'hemidesmosomes) provoca una polaritat acínica i l'aturada del creixement. Utilitzant anticossos bloquejadors, s'ha posat en evidència que les integrines α₆β₄ i α₃β₁ són necessàries per a la migració de les cèl·lules epitelials de la pell. Els senyals generats per la unió de α₆β₄ amb els lligands poden influir en el citosquelet, ja que la llargada de la cua citoplasmàtica de la subunitat β₄ facilita la interacció amb els components del citosquelet a través de plectina, cosa que proporciona a les cèl·lules la polaritat característica. En cèl·lules malignes, en canvi, la senyalització a través de α₆β₄ queda bloquejada, tot i que les cèl·lules expressen nivells elevats de la subunitat β₄, que continua generant senyals d'inducció de la proliferació.

Interaccions entre integrines i laminina en cèl·lules epitelials

L'impacte de la senyalització dependent d'integrines en la forma cel·lular també s'ha demostrat en cèl·lules endotelials angiogèniques, que degraden la làmina basal i proliferen, com a resposta a la bFGF. La proliferació i la supervivència subsegüent de les cèl·lules endotelials depenen de l'adhesió a la MEC a través de les integrines, ja que quan es produeix el bloqueig d'aquestes integrines se'n redueix la proliferació. No obstant això, si bé la integrina α₆β₄ s'expressa en la major part de cèl·lules epitelials, la integrina α₆β₁ només s'expressa en alguns epitelis. La utilització d'anticossos contra la integrina α_Vβ₃ després que les cèl·lules s'hagin estès, també manté la capacitat de proliferació. Sembla que l'extensió de les cèl·lules condueix a la proliferació i que l'arrodoniment s'associa amb l'apoptosi.

Com influeix la forma de la cèl·lula en la senyalització intracel·lular? Els canvis en la morfologia cel·lular poden modular tant la magnitud com la durada de la senyalització d'integrines gràcies a mediadors com ara les MAPK. En efecte, la inducció de l'activitat de les MAPK i la proliferació cel·lular es donen en els fibroblasts quan s'adhereixen i s'estenen sobre tenascina utilitzant les integrines αvβ₃ i α₉β₁, mentre que l'adhesió a tenascina via la integrina αvβ₆ no provoca l'extensió de les cèl·lules i disminueix l'activitat MAPK i la proliferació cel·lular. Així doncs, la morfologia cel·lular dirigida per la MEC i els canvis associats del citosquelet poden coordinar els receptors cel·lulars i les molècules de senyalització intracel·lular, i permeten d'aquesta manera que efectors com són les proteïnes de les adhesions focals (FAK, Ras i Raf) s'associïn amb les molècules diana corresponents (MAPK).

De la mateixa manera, la morfologia cel·lular pot alterar la capacitat de l'ERK d'accedir als gens diana que regula, i consegüentment impedir l'activació de la maquinària del cicle cel·lular. La continuïtat que hi ha entre la MEC, les integrines, el citosquelet i el nucleoplasma pot regular l'accés dels factors de transcripció als gens diana mitjançant una possible modulació de l'estructura de la cromatina i, en particular, de les histones. Quan es cultiven cèl·lules epitelials de glàndula mamària sobre una membrana basal exògena, les cèl·lules adopten una morfologia cuboïdal polaritzada, esdevenen quiescents i expressen nivells elevats de β-caseïna. Si les cèl·lules epitelials s'estenen sobre laminina i s'hi fan créixer, tot i mantenir la interacció amb les integrines β₁, queda suprimida l'expressió de β-caseïna. En les cèl·lules epitelials de la glàndula mamària, per a l'activació transcripcional del gen de la proteïna β-caseïna, es necessita la interacció entre la integrina β₁, la via de senyalització per tirosina-cinases i els canvis morfològics provocats per la làmina basal. L'accés dels factors de transcripció al gen de la β-caseïna depèn en últim terme de l'organització de la cromatina. Així, la forma cel·lular permet la interacció dels efectors reguladors de la via (Ras i Raf) amb els mediadors que són regulats (ERK), i, d'altra banda, la forma cel·lular influeix en la interacció d'aquests mediadors amb els seus gens diana, segons la reorganització de la matriu nuclear i la cromatina associada.

 

 

4. MIGRACIÓ CEL·lULAR

La migració cel·lular és un procés essencial no només per al desenvolupament dels organismes, els mecanismes de defensa i reparació tisular, sinó que també ho és per al desenvolupament de nombrosos processos mòrbids. L'adhesió al substrat mitjançant integrines és una condició necessària perquè tingui lloc la migració, encara que la relació entre ambdues no és senzilla. No obstant això, s'han descrit models matemàtics que permeten apropar-nos al coneixement d'alguns aspectes d'aquesta relació.

Interaccions entre integrines i laminina en cèl·lules epitelials

Així, correlacionant velocitat de migració amb adhesió, s'observa que aquella es distribueix segons una corba normal, sent funció de la concentració de les proteïnes de la matriu, la massa de integrines i estat d'activació. Quan l'adhesió és feble, la velocitat de migració és baixa ja que les cèl·lules no són capaces de produir suficient força de tracció. Amb l'augment de l'adhesió, també s'incrementa la velocitat, però si és excessiva, la velocitat es veu afectada negativament ja que les regions membranoses que participen en l'adhesió no poden transitar entre els estats adhesiu i no adhesiu.

La migració, quan es produeix, és un mecanisme cel·lular que permet el desplaçament cel·lular, tant de manera individual com en agrupacions cel·lulars, tal com succeeix en el desenvolupament ductal, la angiogènesi o en la reparació de ferides. Es produeix, habitualment, després d'un estímul extern que és transduït, intracel·lularment, per molècules com GTPases, proteïnes dependents de Ca²⁺, MAPK,s, PKC,s, PIK,s, PLC, PLD i TK, donant lloc, finalment, a canvis en el citosquelet, l'adhesió cel·lular i la matriu extracel·lular.

En l'actualitat es considera que el complex procés de migració cel·lular és una successió de quatre etapes essencials, com són (i) expansió lamedipodial, (ii) acoblament anterior de complexos adhesius, (iii) contracció cel·lular i (iv) desensamblatge posterior de complexos adhesius en la regió posterior.

Moviment cel·lular

4.1 Expansió lamedipodial

Consisteix en una protrusió cel·lular en forma de lamelipodi, també denominada front d'avanç, i localitzada en el pol anterior de la cèl·lula en migració. Aquest procés resulta de la polimerització de actina G, ja que quan s'injecten molècules fluorescents, aquestes són transportades ràpidament al front d'avanç. Una vegada allí polimeritzen en forma de xarxa, gràcies a l'activitat nucleadora del complex Arp2/3, facilitant secundàriament la protrusió a causa de l'influx d'aigua impulsada pel gradient osmòtic. No obstant això, deu tenir-se en compte que juntament amb Arp2/3 i Rac, altres molècules implicades en la regulació del citosquelet de actina, com VASP, WASP, profilina, VASP, integrines, α-actinina i GIT1 estan presents en el front d'avanç.

La formació del lamelipodi és dependent de l'activació de GTPases Rac, després de la seva inducció per quimioquines, citoquines, factors de creixement i components de la matriu extracel·lular. Sent l'activació de les isoformes Rac1 i Rac2 (existeixen dubtes sobre el paper jugat per Rac3) el pas essencial per a l'extensió del lamelipodi, existeixen models que demostren l'independència d'aquesta respecte de Rac, sent controlada per Rab5 (cèl·lules dendrítiques) o Rho (carcinoma de colon).

Rac pot ser activat per proteïnes G i tirosíncinases a través de PI 3-cinasa, els productes de la qual PI(3,4,5)P₃ i PI(3,4)P₂, els quals es troben en alta concentració en el front d'avanç, regulen els factors intercambiadors de nucleòtids Tiam1 i Vav1. Alternativament, Rac pot ser activat a través del complex Crk/DOCK180, sent aquest últim un activador (sense activitat GEF) de Rac dependent de PI(3,4,5)P₃. Aquesta via és comú a la senyalització per integrines, encara que l'activació de Rac per aquestes podria incloure als factors intercambiadors Vav (activat per Src) i/o Sos1 (a través de les proteïnes adaptadores Eps8 i I3b1). No obstant això, en el cas de les integrines β3, l'activació de Rac depèn de l'agregació de integrines i de l'activitat proteolítica de calpaïna.

La coordinació exercida per Rac durant l'extensió lamelipodial resulta de l'estimulació de la polimerització d'actina, bé activant el complex Arp2/3 (a través de Rac/IRSp53/WAVE/Arp2/3), bé promovent del desbloqueig dels extrems de actina F a través del segrest de les proteïnes bloquejadores per PIP₂ (Rac/PIP5K/ PIP₂). A més, Rac podria controlar la taxa de despolimerització de la actina a través de l'estimulació de LIM-cinasa, la qual fosforil·la, inactivant-la, a cofilina, una proteïna despolimeritzadora de actina F. No obstant això es demostra que, per contra, l'activitat de cofilina és requerida per a l'expansió lamelipodial, probablement pel paper que juga en la imprescindible reorganització del citosquelet de actina durant la migració.

Per altra banda, Rac regula l'activitat de miosines, implicades així mateix en l'extensió del lamelipodi, mitjançant la fosforil·lació de la cadena pesada (MHC) i lleugera (MLC) de miosina II a través de PAK. Aquestes fosforil·lacions tenen, no obstant això, efectes contraris ja que, mentre la fosforil·lació de MLC recluta miosina en el lamelipodi creixent, la modificació de MHC promou la redistribució de la miosina fora de l'expansió membranosa. Aquests efectes contraposats es deuen al fet que són específics del tipus cel·lular estudiat i, a més, es demostra que les pròpies miosinas poden ser reguladores de l'activitat de Rac.

Finalment, la inhibició de RhoA facilita la protrusió cel·lular i la migració, ja que d'ella es deriva la relaxació de les fibres d'estrès. És un procés controlat per la fosforil·lació d'una GAP per a Rho, p190RhoGAP, la qual és dependent de l'adhesió per integrines i l'activitat Src.

 

4.2 Acoblament anterior de complexos adhesius

La protrusió cel·lular ocasionada per l'organització del lamelipodi està acoblada a la formació de complexos d'adhesió al substrat, els quals estabilitzen aquella protrusió. Aquesta estabilització pot ser més o menys duradora en el temps d'acord amb les molècules que intervinguin en la formació dels complexos adhesius. Així, aquells que contenen paxilina són reciclats cap als neoformats en el pol anterior de la cèl·lula emigrant, mentre que aquells que presenten α-actinina, no són reciclats, almenys en temps curts, redistribuint-se cap a localitzacions més centrades. Aquesta estabilització adhesiva és dependent de l'activitat Rho, madurant els complexos focals cap a tipologies d'adhesions focals, dificultant, així la migració cel·lular. A més, el reclutament dels elements moleculars necessaris per a la constitució de nous complexos es realitza de manera seqüencial específica del pol anterior, afectant tant a les molècules reciclades de la regió posterior, com als elements de nova síntesi que s'incorporen.

S'han descrit diversos mecanismes de transport d'integrines i altres proteïnes dels complexos d'adhesió cap a la regió del front d'avanç. Així, les vesícules endocítiques constitueixen un mitjà de gran capacitat de càrrega per a traslladar no només molècules que participen en l'adhesió, sinó també la membrana requerida per a organitzar el lamelipodi. Encara que el transport membranós no sigui únic, o tant sols el predominant, existeixen evidències que les molècules adhesives i senyalitzadores són transportades formant complexos a través d'un compartiment perinuclear, connectant les regions posterior i anterior de la cèl·lula, i que bé podria estar relacionat amb el reciclatge endocític. Rac pot regular el reciclatge dels complexos d'adhesió tant directament com antagonitzant l'activitat de Rho. Juntament amb Rac, diverses proteïnes activadores (GAP) i la família de GTPases ARF juguen un important paper en el transport direccionat que representa el reciclatge. Així, una proteïna de la família GIT (GAP per a ARF), p95-APP1, estimula el transport de Rac des dels endosomes a la membrana en un procés que depèn de ARF6, mentre que ARF1 promou el reclutament de paxilina no acomplexada des de la regió perinuclear fins els llocs de formació de complexos adhesius. Per altra banda, GIT1 presenta un cicle de transport que comprèn les adhesions en la zona posterior, els compartiments perinuclears i el front d'avanç. Aquesta proteïna forma complexos multimoleculars amb ARF, PAK (u dels efectores de Rac), el factor intercanviador de nucleòtids PIX, paxilina i la proteïna adaptadora Nck, que associats a membrana o no, faciliten tant el desensamblatge com la formació de noves adhesions en la regió anterior, procés que és depenent de l'activitat Rac.

Finalment, Rac (encara que també Cdc42) pot regular la protrusió lamedipodial a través del control de l'estabilitat dels microtúbuls, els quals són necessaris per a dirigir l'aport de molècules i vesícules de manera polaritzada cap al front d'avanç. Aquest control s'exerciria a través de stathmin, una proteïna associada a microtúbuls, que, a l'ésser fosforil·lada per PAK, quedaria inhabilitada per a exercir la seva funció desestabilitzadora.

 

4.3 Contracció cel·lular

Depèn de la contractibilitat dels complexos de actomiosina, capacitat cel·lular que és regulada essencialment per Rho. Aquesta GTPasa controla, a través del seu efector ROCK, la fosforil·lació activadora de la cadena lleugera de la miosina (MLC), tant per fosforil·lació directa de MLC, com inhibint, també per fosforil·lació, l'acció de la fosfatasa de MLC. A més, MLC és fosforil·lada específicament per una cinasa, MLCK, que és activada per Ca²⁺ i estimulada per ERK. Ambdós controls, ROCK i MLCK, es distribueixen regionalment, ja que la primera exerceix la seva funció en el cos cel·lular, mentre que la segona ho fa en la perifèria.

A més ROCK afavoreix la polimerització d'actina F tant a l'inhibir l'activitat despolimerizadora de cofilina mitjançant la seva fosforil·lació, com al activar PIP5K. Aquesta estimulació de la polimerització també és exercida a través de Dia, altre efector de Rho, a través del reclutament de actina G intervingut per profilina. L'activitat de Dia és modulada, a més, per interacció directa de Src, la qual promou la pèrdua d'adhesions focals.

Per una altra banda, Dia pot col·laborar en la necessària reorganització dels microtúbuls que acompanya a la migració (incloent el paper exercit en el transport) ja que controla la polarització dels mateixos, en la qual també s'ha descrit una intervenció de Rac (a través de PAK/stathmin) i Cdc42 (a través de CIP4 o PARELL6).

4.4 Desacoblament posterior dels complexos adhesius

L'evidència experimental indica que l'absència d'activitat de FAK produeix fenotips cel·lulars amb reduïda mobilitat i a un increment en el nombre i grandària dels complexos d'adhesió, permet suposar que aquesta cinasa (especialment, els dominis cinasa i el primer dels dominis rics en prolina) és essencial en el reciclatge dels elements integrats en aquests complexes. Fenotips semblants són obtinguts en cèl·lules deficients en les tir