 |
 |
 |
Nivells d'organització
ÍNDEX
1. Les integrines a la fecundació i la implantació
1.1 La fecundació
La fecundació es defineix com el procés d'unió de dos gàmetes, l'oòcit i l'espermatozoide. La fecundació és una de les interaccions cèl·lula-cèl·lula més específiques i curosament regulades dels éssers vius. Està determinada per la compatibilitat entre molècules lligand i receptor de la superfície de cadascun dels gàmetes. Tant els espermatozoides com els oòcits expressen integrines i molècules que contenen llocs de reconeixement d'integrines (incloent-hi components de la matriu extracel·lular) que estan involucrades en la unió i la fusió de les membranes plasmàtiques de les dues cèl·lules.
El procés de la fecundació comprèn interaccions d'adhesió entre els gàmetes a diferents nivells de proximitat:
• Penetració de l'espermatozoide a través de les cèl·lules del cúmul que envolten l'oòcit.
• Primera adhesió: penetració de l'espermatozoide per la zona pel·lúcida.
• Segona adhesió: unió i fusió de les membranes plasmàtiques de les dues cèl·lules.
 |
Etapes de la fecundació |
1.1.1. Pas pel cúmul
Després de l'oocitació, en la major part del mamífers, el cúmul que envolta l'oòcit està format per cèl·lules i abundant matriu extracel·lular. La penetració de l'espermatozoide a través del cúmul es produeix gràcies a la remodelació de la matriu extracel·lular que la mateixa cèl·lula provoca. Experimentalment s'ha observat que la presència del cúmul augmenta el percentatge de fecundació in vitro, cosa que suggereix, per tant, que té una funció important in vivo. Es considera que les cèl·lules del cúmul creen un microambient favorable a la capacitació i la penetració de l'espermatozoide. Les reaccions conegudes fins ara entre l'espermatozoide i el cúmul es donen per l'actuació del gàmeta sobre la matriu extracel·lular, que desencadena la hidròlisi de part dels seus components. En tots els organismes es reconeix l'activitat hialuronidasa de l'espermatozoide com el principal factor que obre el pas a través del cúmul, però en algunes espècies s'ha reconegut, a més a més, la col·laboració d'integrines de la regió més apical del cap de l'espermatozoide.
PH-20
La molècula més implicada en aquest procés és la PH-20, que està ancorada a la membrana plasmática de l'espermatozoide per un GPI (glicosilfosfatidilinositol). Es tracta d'una proteïna bifuncional amb activitat alterna de dispersió del cúmul i d'adhesió cel·lular. La dispersió del cúmul es produeix gràcies a la capacitat hialuronidasa de la proteïna, que permet separar les cèl·lules fol·liculars.
L'adhesió cel·lular es produeix probablement perquè l'àcid hialurònic s'enganxa a la PH-20, cosa que indueix una agregació de receptors que, al seu torn, desencadenen una senyalització intracel·lular. L'àcid hialurònic de la matriu extracel·lular del cúmul indueix l'increment del calci intracel·lular en l'espermatozoide, mitjançant la proteïna PH-20. És conegut que l'àcid hialurònic de la matriu extracel·lular del cúmul facilita la fecundació. A més, incrementa el nombre d'espermatozoides que experimenten la reacció acrosòmica en arribar a la zona pel·lúcida. L'àcid hialurònic augmenta la concentració de Ca2+ per mitjà de la interacció amb la PH-20 de la membrana. Com a resultat, l'espermatozoide experimenta un augment del Ca2+ basal. En moltes espècies de mamífers s'ha posat de manifest que la interacció de l'àcid hialurònic i la PH-20 facilita l'apropament de l'espermatozoide a la zona pel·lúcida, i aquesta acció és necessària per a la reacció acrosòmica posterior.
L'àcid hialurònic (AH) inicia processos de senyalització intracel·lular en altres cèl·lules. Per exemple, s'uneix a receptors específics de la membrana dels limfòcits i indueix l'agregació cel·lular, la fosforilació de la tirosina, la formació de IP3 i l'alliberament del Ca2+ intracel·lular.
Integrines de la membrana plasmàtica de l'espermatozoide
Mitjançant tècniques d'immunofluorescència s'han localitzat moltes subunitats d'integrines a la membrana plasmàtica del cap dels espermatozoides de diferents organismes. Estan repartides entre la regió de l'acrosoma, la regió equatorial, la regió postequatorial i el coll. En els espermatozoides d'alguns mamífers, durant la capacitació s'ha localitzat la integrina α5ß1; i després de la reacció acrosòmica, αvß3. En la regió equatorial, α3, α4 i α6. Durant el pas pel cúmul, en algunes espècies de mamífers, concretament en els espermatozoides de porc, s'ha detectat el dímer VLA-6 (α6ß1).
VLA-6 (α6ß1)
VLA-6 (α6ß1) és un antigen leucocític dels VLA (very late antigen) que presenten com a contrareceptors molècules de la matriu extracel·lular (vegeu l'apartat "Les integrines en la migració transendotelial"). Aquest dímer s'expressa a la regió acrosòmica de l'espermatozoide de porc, capacitat però que no ha reaccionat. La seva distribució al cap de l'espermatozoide es modifica i concentra a mesura que progressa la capacitació. En ser exposat a la laminina del cúmul expandit, desencadena una via de senyalització, cosa que indueix la reacció acrosòmica. Això no vol dir que competeixi amb els mecanismes de senyalització que es produeixin en l'etapa següent, en entrar en contacte amb la zona. L'alliberament del Ca2+ és en una zona molt localitzada, allà on s'expressa VLA-6.
1.1.2. Interacció espermatozoide-zona pel·lúcida
Passat el cúmul, l'espermatozoide i l'oòcit es troben. L'espermatozoide entra en contacte amb la zona pel·lúcida, que és la coberta extracel·lular de glicoproteïnes que envolta l'oòcit. La zona pel·lúcida està formada per tres famílies de glicoproteïnes: ZP1, ZP2 i ZP3. Les interaccions moleculars entre l'espermatozoide i la zona pel·lúcida són, en general, -específiques d'espècie. En la zona pel·lúcida, l'activitat dels receptors de l'espermatozoide està associada amb les glicoproteïnes, la ZP3 com a primer receptor i la ZP2 com a segon receptor. Concretament, a la membrana de l'espermatozoide hi ha molècules que interactuen amb els glicans de la zona pel·lúcida i desencadenen una via de transducció de senyals que provoca la reacció acrosòmica, és a dir, l'exocitosi de la vesícula acrosòmica. La reacció acrosòmica és un pas indispensable per tal que l'espermatozoide s'uneixi i es fusioni amb la membrana plasmàtica de l'oòcit.
Els receptors de la zona pel·lúcida als espermatozoides no reaccionats són a la part anterior del cap de la cèl·lula, concentrats en una banda molt estreta, sobre la punta de l'acrosoma. L'organització i l'estructuració d'aquesta zona es produeix durant la maduració en l'epidídim.
 |
Adhesió oòcit / espermatozoide |
Receptors de les glicoproteïnes de la zona pel·lúcida (EBP, egg-binding protein)
Diverses proteïnes de l'espermatozoide poden considerar-se EBP en les diferents espècies de mamífers: la ß-galactosiltranferasa, la proteïna 56, la zonadhesina, l'espermadhesina, i d'altres. Les característiques d'aquestes molècules indiquen que poden actuar individualment o col·lectivament formant complexos, i manifestar afinitat diferent amb el receptor.
La reacció acrosòmica permet a l'espermatozoide de penetrar en la zona pel·lúcida i, aleshores, unir-se i fusionar-se amb la membrana plasmàtica de l'oòcit. Consisteix en l'exocitosi de la vesícula acrosòmica i en l'alliberament del contingut enzimàtic amb l'exposició consegüent de la membrana interna de l'acrosoma. L'espermatozoide comença a penetrar en la zona pel·lúcida i accedeix a l'espai perivitel·lí, on s'uneix als receptors de l'oolemma. La reacció acrosòmica és un pas indispensable per tal que l'espermatozoide s'uneixi i es fusioni amb la membrana plasmàtica de l'oòcit.
 |
Reacció acrosòmica |
1.1.3. Segona adhesió: unió i fusió de les membranes plasmàtiques
Salvades les barreres del cúmul i la zona pel·lúcida, els dos gàmetes entren en contacte directe, l'espermatozoide reaccionat s'uneix i es fusiona amb l'oòcit. La fusió es dóna entre els microvil·lis de la superfície de l'oòcit i la membrana de la regió postacrosòmica de l'espermatozoide.
En aquest procés, hi estan implicades proteïnes ADAM de l'espermatozoide i integrines de la membrana plasmàtica de l'oòcit.
Desintegrines (ADAM) espermàtiques
Les ADAM són glicoproteïnes transmembranoses que presenten dominis desintegrina amb homologia als lligands de les integrines (vegeu l'apartat "Les molècules d'adhesió").
Diversos membres de la família de les ADAM s'expressen predominantment en els espermatozoides testiculars durant el procés de desenvolupament. En general es localitzen al cap de les cèl·lules.
És clar que almenys tres d'aquestes ADAM espermàtiques, la fertilina β (PH-30 beta, ADAM 1), la fertilina alfa (PH-30 alfa, ADAM 2) i la ciritestina (ADAM 3), participen en la fecundació. Són lligands de proteïnes de la membrana plasmàtica de l'oòcit. Utilitzen les seves seqüències de desintegrina per interactuar amb algunes integrines de la membrana de l'oòcit i fan de mediadores de l'adhesió dels dos gàmetes i la fusió de les membranes.
L'activitat de les fertilines es manifesta necessària durant els processos previs a la fecundació en la capacitació de l'espermatozoide i en la seva mobilitat per l'oviducte.
Les més ben caracteritzades són la fertilina β i la fertilina α, que han estat aïllades de la membrana plasmàtica de l'espermatozoide de cobai. Se sintetitzen en forma de precursors i són processades fins a la forma molecular definitiva, durant el procés de maduració dels espermatozoides, però en diferents etapes. La fertilina alfa és processada en el testicle, mentre que la beta ho és en l'epidídim. Ambdues formen la fertilina (abans anomenada PH-30). És un heterodímer que s'ha localitzat exclusivament a la membrana plasmàtica dels espermatozoides.
 |
Fertilina |
La fertilina beta és una glicoproteïna transmembranosa de la família de les ADAM, localitzada a la regió posterior del cap de l'espermatozoide. El domini desintegrina de la molècula s'uneix probablement a integrines de la membrana de l'oòcit com a preludi de la fusió dels gàmetes. La fertilina alfa, a més del domini desintegrina, presenta una seqüència que en experiments in vitro s'ha confirmat com el lloc de fusió amb la membrana de l'oòcit. La ciritestina és una proteïna polimòrfica que s'expressa a la membrana interna de l'acrosoma, es troba en les formes ciritestina 1 (ADAM 3 A) i ciritestina 2 (ADAM 3 B), que sembla que pot formar part d'una via alternativa de la unió i la fecundació independent de la fertilines alfa i beta. La ciritestina, a més, té un paper supraregulador i modulador de l'activitat de les altres dues ADAM. Els seus receptors són les integrines de l'oòcit.
Els espermatozoides d'individus mutants defectius en l'expressió d'aquestes ADAM presenten sempre un descens de la capacitat fecundant. Aquest fet indica que aquestes molècules formen part d'un conjunt més ampli d'elements que, integrats adequadament, permeten la unió i la fusió dels gàmetes.
Integrines dels oòcits
Les integrines dels oòcits són els possibles receptors de les desintegrines dels espermatozoides. Diverses subunitats d'integrines (α1, α2, α3, α4, α5, α6, αv i αM ß1, ß2, ß3, ß5) s'han localitzat a la membrana plasmàtica dels oòcits de diferents espècies de mamífers, mitjançant immunocitoquímica i microscòpia confocal. Probablement algunes d'aquestes molècules de la superfície de l'oòcit, estan implicades en la interacció espermatozoide-oòcit en els mamífers.
Són receptors transductors de senyals que, en unir-se als lligands de l'espermatozoide, desencadenen una sèrie de respostes en l'oòcit necessàries per a la seva activació (sortida de l'aturada meiòtica) i inici de l'embriogènesi. Les diferències entre les espècies de mamífers quant a les subunitats de les integrines poden contribuir a les interaccions específiques d'espècie entre oòcits i espermatozoides.
Sovint, els dímers d'integrines formats per la combinació d'aquestes subunitats, segons quin sigui l'estat funcional d'avidesa, d'afinitat i de modulació amb els lligands en què es troben, determinen la viabilitat de la fecundació.
La integrina α6ß1 sembla que és la integrina més involucrada en els processos d'unió i fusió dels gàmetes. Les dues subunitats es localitzen en els microvil·lis de la regió de l'oòcit on s'enganxa l'espermatozoide i el seu bloqueig determina un alt fracàs de la fecundació. Interactua principalment amb la fertilina beta i la ciritestina. La unió d'aquesta integrina amb les ADAM de l'espermatozoide necessita la cooperació d'altres proteïnes de la membrana plasmàtica, fet que es dóna també en altres models cel·lulars (vegeu l'apartat "Integrines. Interaccions laterals").
Un exemple d'aquesta cooperació és la de la CD9, una tetraspanina
que s'associa a moltes integrines ß1, la α6ß1
inclosa. La CD9 és present a la membrana plasmàtica dels oòcits
de l'ovari, com també als oòcits aïllats de l'oviducte.
L'alta afinitat d'unió entre la fertilina beta i la α6ß1
requereix la cooperació entre la α6ß1
i la CD9. Aquesta cooperació pot ajudar al pas per l'oviducte, i
també la interacció espermatozoide-oòcit.
A continuació de l'adhesió, es produeix la fusió de les membranes. La base molecular de la fusió és poc coneguda. Els heterodímers de fertilina dels espermatozoides, en entrar en contacte amb la integrina pel seu domini desintegrina, experimenten un canvi conformacional de manera que deixen al descobert la regió de fusió que es combinarà amb el pèptid de fusió de l'oolemma i permetrà que les dues membranes s'uneixin i formin un porus de fusió per poder entrar al nucli de l'espermatozoide.
La interacció de les membranes dels gàmetes determina l'activació de l'oòcit i l'inici del desenvolupament embrionari.
És interessant assenyalar que no sempre els oòcits presenten al seu voltant la zona pel·lúcida. Els oòcits de molts invertebrats estan només recoberts per la membrana vitel·lina, que és la coberta de matriu extracel·lular de la pròpia cèl·lula. En aquests organismes, les integrines proporcionen punts d'unió de la membrana vitel·lina a l'oòcit i propicien la formació de la membrana de fecundació a falta de zona pel·lúcida.
Un exemple d'això és la αBßC, integrina que s'expressa en la superfície dels oòcits d'eriçó de mar no fecundats, en la punta dels microvil·lis i que enganxa l'oòcit amb la membrana vitel·lina. Les subunitats d'aquesta integrina són també presents en els grànuls corticals. La reacció cortical permet que les subunitats alliberades intervinguin en la separació de la membrana de fecundació en absència de la zona pel·lúcida, ja que s'uneixen al citosquelet cortical i l'ancoren sota la membrana de fecundació per donar-li consistència.
 |
Activació de l'oòcit |
Activació de l'oòcit
L'activació de l'oòcit es dóna després de la fecundació i desencadena l'inici del desenvolupament embrionari. En tots els organismes estudiats, tant animals com vegetals, l'activació de l'oòcit comporta un augment del Ca2+ citosòlic. Aquest augment varia en el temps i en l'espai segons les espècies.
La unió d'un lligand de l'espermatozoide -ADAM- amb el receptor de l'oòcit -integrines- desencadena una via de transducció de senyals que determina l'alliberament del Ca2+. En els mamífers, la via de senyalització es produeix mitjançant la ruta dels fosfolípids d'inositol que, com s'ha vist en l'apartat "La senyalització per integrines", determina la mobilització del Ca2+ intracel·lular.
La primera resposta a l'increment de la concentració del Ca2+ és la sortida de l'aturada meiòtica fins a completar la segona divisió, i l'exocitosi dels grànuls corticals per prevenir la polispèrmia.
Les respostes posteriors inclouen l'increment de l'mRNA per a la traducció, canvis en la síntesi de proteïnes i l'activació del genoma del zigot.
1.2 La implantació
La implantació és un procés característic dels mamífers, significa l'establiment d'una connexió íntima tròfica entre la mare i l'embrió. A mesura que l'òvul fecundat es desplaça per l'oviducte es divideix repetidament, fins a formar la mòrula. En arribar a l'úter està constituït ja com a blastocist, i a les hores s'implanta en la superfície de l'endometri. Les cèl·lules del blastocist formen una coberta esfèrica al voltant de la cavitat central plena de líquid que és el balstocel. En aquest estadi destaca un cúmul de cèl·lules: la massa cel·lular interna, i la capa externa de cèl·lules que constitueix el trofoblast. L'embrió pròpiament dit deriva totalment de la massa cel·lular interna i és a partir d'aquesta estructura que s'obtenen les cèl·lules mare embrionàries de l'embrió preimplantacional, que són cèl·lules capaces de diferenciar-se en qualsevol tipus de cel·lular de l'organisme.
La resta de les cèl·lules del blastocist, formen el trofoblast
que és el precursor de la placenta i el primer component del sistema
d'estructures extraembrionàries. Les cèl·lules del
trofoblast s'adhereixen a l'endometri i, en algunes espècies (com
ara la humana), l'envaeixen activament.
L'endometri és la mucosa que revesteix la cavitat de l'úter
on s'implanta l'embrió. Consta d'un epiteli cilíndric senzill
del que surten glàndules tubulars que s'estenen profundament endinsant-se
en una làmina pròpia molt gruixuda que s'anomena estroma endometrial.
El procés de la implantació comença quan el blastocist
es deposat sobre l'epiteli uterí. Es produeixen una sèrie
d'interaccions coordinades que comencen amb el contacte entre la membrana
apical de les cèl·lules del trofoblast i les cèl·lules
de l'epiteli luminal de l'úter. És un contacte de característiques
molt peculiars, ja que estableix adhesió i unió entre dos
teixits genèticament diferents. (Paradoxa immunològica).
La implantació és desenvolupa seguint una seqüència
ben coordinada d'esdeveniments que com ja s'ha dit impliquen l'aposició,
el reconeixement, l'adhesió entre l'úter i l'embrió.
La interacció entre l'embrió i l'epiteli uterí és
molt similar a la dels leucòcits i l'endoteli, així com els
processos de metastasi en els que les integrines són les molècules
determinants en el procés final d'adhesió i unió. (Vegeu
Les integrines en la migració transendotelial, Integrines i processos
patològics, i Integrines i càncer).
L'úter i el blastocist han de devenir aptes per a la implantació.
L'endometri ha de passar d'un estadi no receptiu a un estadi receptiu i
el blastocist ha de ser activat. El canvi comença a la fase lútia
del cicle ovàric, sota la influència de les hormones sexuals
(progesterona i estrògens), factors de creixement i agents angiogènics.
L'activació del blastocist s'inicia també pels estrogens de
l'ovari, induint probablement l'expressió de molècules d'adhesió
i receptors de factors de creixement en la seva superfície cel·lular.
1.2.1 Trofoblast
El trofoblast forma dues capes, una interna el citotrofoblast o capa de cèl·lules mononucleades, i una altra d'externa o sinciciotrofoblast, resultat de la fusió de les cèl·lules del citotrofoblast formant una capa de protoplasma polinucleat. Aquesta capa desenvolupa projeccions digitiformes cap a l'endometri, i es formen les vellositats corials. Al entrar en contacte amb la paret de l'úter, algunes cèl·lules de les vellositats adquireixen un fenotip invasiu i envaeixen l'endometri mentre que les cèl·lules de les vellositats flotants (no adherides) no presenten aquest capacitat invasiva. L'adquisició del fenotip invasiu es manifesta amb molts canvis en l'expressió de les integrines.
L'endometri respon a la invasió amb canvis en el seu estroma. L'endometri
modificat és ara la decidua. La decidualització comporta la
remodelació de la matriu extracel·lular i també canvis
en l'expressió de les integrines
1.2.2 Adhesió trofoblast-úter
Abans de l'embaràs la matriu extracel·lular de l'estroma de l'endometri humà, conté principalment, col·làgena I, III, i VI, fibronectina i tenascina. Durant la decidualització, les cèl·lules sintetitzen una matriu extracel·lular que presenta col·làgena IV, heparan sulfat i laminina.
L'epiteli de l'endometri durant la fase lútia del cicle expressa
les subunitats α1 i α4, mentre que la subunitat ß3 apareix al final
d'aquesta fase, coexistin amb les subunitats α1 i α4 quan l'embrió
s'implanta. En resum, durant aquest període es forma el dímer
α4 ß3 indicador de l'inici de la implantació.
També hi són presents αv i ß1 que indueixen la dimerització
de αvß3, αvß1, α4 ß1 i α1ß1
La integrina αvß3 està simultàniament present en
l'epiteli uterí i en el trofoblast i presenten interaccions creuades
per fer possible l'anclatge. L' αvß3 trofoblàstica reconeix
la osteopontina de l'endometri, i l'αvß3 de l'endometri interactua
amb la vitronectina i la fibronectina present en el trofoblast. En l'úter
només s'expressa entre el dies 19 i 24 del cicle menstrual, el període
de receptivitat òptima pel blastocist. Aquest fet és extraordinàriament
important, ja que aquesta integrina no està present en l'epiteli
uterí de dones infèrtils que presenten anomalies en la fase
lútia.
 |
Implantació: Adhesió blastocit / endometri |
 |
Implantació: Invasió de l'epiteli uterí |
1.2.3 Moviment dels blastocist en l'úter. Invasió del trofoblast.
Seguit de la adhesió superficial, en els organismes que presenten implantació invasiva, les cèl·lules de fenotip invasiu comencen la secreció de collagenases per tal de desorganitzar la matriu extracel·lular. Així que el citotrofoblast migra per dins de la decidua, el patró de les seves molècules d'adhesió canvia. Hi ha un canvi gradual en l'expressió de les integrines entre les cèl·lules del citotrofoblast que es troben a la base de la vellositat i les que es van allunyant. Les cèl·lules del citotrofoblast pròxim a la base de la vellositat expressa α6ß4. Aquesta integrina forma part dels hemidesmosomes i és habitual en alguns epitelis. (Vegeu el capítol Hemidesmosomes) Aquestes cèl·lules també expressen les integrines αvß4 i αvß6, el que impedeix la migració cel·lular. Així que el citotrofoblast va formant les vellositats les integrines indicades deixen d'expressar-se i les cèl·lules més properes a la paret de l'endometri expressen αvß3 que facilita la invasió. Finalment, quan el citotrofoblast assoleix la regió intersticial de l'úter expressa α1ß1 un receptor de laminina i col·lagena.
Les integrines estan implicades en la invasió del trofoblast i el
desenvolupament placentari. Algunes, incloses αvß4, αvß5
i αvß6 limiten la migració, d'altres com ara αvß3
i αvß1 la faciliten. L'equilibri entre l'activitat d'aquestes
integrines permet la implantació normal i el posterior desenvolupament
del nou individu.
 |
Implantació: Vellositat corial |
2. Les integrines a l'epidermis de la pell
Com a receptors d'elements de matriu extracel·lular, les integrines intervenen en el desenvolupament, la configuració, el manteniment i la reparació de teixits i òrgans. Lògicament, l'especificitat és un tret essencial d'aquesta intervenció, però no l'únic. La seqüència espaciotemporal de l'expressió i la funcionalitat d'aquests receptors, són els trets que n'acaben de definir la influència
2.1 La proliferació cel·lular i la diferenciació terminal caracteritzen l'epidermis
La pell de mamífer és un òrgan format per diferents teixits estratificats que recobreix la superfície externa del cos i les obertures externes de diferents òrgans i sistemes. Els teixits que la integren són:
- l'epidermis, que és un teixit epitelial pluriestratificat escatós extern, d'origen ectodèrmic, normalment molt més prim que el derma, i que està en contacte directe amb l'entorn subaeri de l'organisme, i
- el derma, que és un teixit intern de naturalesa conjuntiva i d'origen mesenquimàtic, irrigat i innervat, on es troben els fol·licles pilosos, les glàndules sebàcies i sudorípares.
 |
Pell |
La pluriestratificació de l'epidermis queda definida per quatre estrats cel·lulars, ordenats espacialment de dins a fora i anomenats amb una terminologia que sorgeix dels estudis primigenis de microscòpia òptica:
- l'estrat basal o germinatiu, en contacte amb el derma, és la zona de proliferació cel·lular i, per tant, està format per cèl·lules indiferenciades;
- l'estrat espinós o fonamental, dit així per l'abundor de filaments intermedis i desmosomes puntiformes;
- l'estrat granulós, que té cèl·lules riques en grànuls de naturalesa eosinòfila;
- l'estrat corni, les cèl·lules del qual estan altament modificades, ja que, més que cèl·lules, són escates derivades de cèl·lules, la perifèria de les quals està ocupada per una coberta cornificada formada per diferents proteïnes estructurals i filaments intermedis agrupats en feixos.
La queratina és la proteïna constituent dels filaments intermedis de les cèl·lules epidèrmiques. Per aquesta raó, aquestes cèl·lules s'anomenen queratinòcits, llevat de les cèl·lules de l'estrat corni, amb les quals, a causa de la seva especialització particular, s'empra el terme de corneòcits.
La successió espacial dels estrats epidèrmics està
en consonància amb una evolució temporal dels queratinòcits.
Aquesta evolució comença a l'estrat basal, no solament amb
la proliferació cel·lular, sinó també amb la
diferenciació. El primer tret de la diferenciació és
la desadhesió dels queratinòcits de la làmina basal
i l'emigració cap a una localització suprabasal, on la diferenciació
progressa i els queratinòcits experimenten els canvis morfològics
i estructurals corresponents als diferents estrats. Aquests canvis van lligats
a una variació dels patrons d'expressió de diferents proteïnes
reguladores i estructurals, concretament de les queratines. La diferenciació
acaba amb la mort cel·lular, que presenta algunes característiques
de l'apoptosi, però no totes. D'aquí prové el nom de
diferenciació terminal donat a l'evolució espaciotemporal
dels queratinòcits epidèrmics.
En aquest context histològic, l'epiteli epidèrmic descansa
en una làmina basal que el separa del derma. Els components
d'aquesta làmina han de fer de lligands per a receptors de l'epiteli
situats, lògicament, a la seva base. Aquesta és, doncs, la
localització de les integrines a l'epidermis de la pell, expressades
en els queratinòcits basals de l'estrat germinatiu en condicions
normals in vivo.
2.2 Les integrines de les subfamílies ß1 i ß4 es localitzen a la interfície epidermis-derma
L'espai que hi ha entre l'estrat basal de l'epidermis i el teixit circumdant del derma està ocupat per la làmina basal, matriu extracel·lular especialitzada, que no solament està associada a epitelis sinó que també envolta fibres musculars i ocupa els espais sinàptics.
A l'epidermis, la làmina basal fa, fonamentalment, de suport mecànic,
i preserva la integritat estructural de l'epiteli davant les inevitables
contingències mecàniques. Malgrat això, permet un intercanvi
controlat de molècules entre el derma i l'epidermis, en funció
de la càrrega i la mida. També permet la migració de
cèl·lules com ara melanòcits o cèl·lules
de Langerhans, en condicions normals, o d'altres cèl·lules
com ara leucòcits en condicions patològiques. D'altra banda,
com que la làmina basal conté lligands que són reconeguts
per integrines i aquests receptors són transductors de les senyals
que origina aquest reconeixement, la làmina basal influencia el comportament
dels queratinòcits i modula la polaritat cel·lular, la proliferació,
la migració i la diferenciació. Al microscopi electrònic,
la làmina basal de l'epidermis presenta poques novetats respecte
d'altres làmines basals. Es distingeixen tres làmines o capes,
segons la densitat electrònica, que són, en direcció
epidermis-derma: la làmina lúcida, la làmina densa
i la làmina subbasal.
Els hemidesmosomes constitueixen les estructures d'adhesió basal que col·laboren a contrarestar les forces mecàniques de l'epidermis. Consegüentment, la làmina basal associada té una configuració molecular específica. A la làmina lúcida hi ha els anomenats filaments d'ancoratge, formats per laminina 5, que al seu torn connecten amb les fibril·les d'ancoratge, que hi ha a la làmina densa i estan formades per col·lagen de tipus VII. Tot plegat forma l'anomenat complex d'ancoratge. A la làmina basal interhemidesmosòmica, les laminines 1, 6/7 així com la laminina 5, interaccionant amb proteïnes associades com ara el nidogen, i el col·lagen IV, constitueixen la trama macromolecular, situada en les làmines lúcida i densa.
Com veurem a l'apartat corresponent, la integrina α6ß4 forma part i és exclusiva dels hemidesmosomes a l'epidermis adulta. Expressada únicament al domini basal de la membrana dels queratinòcits de l'estrat germinatiu, té la laminina 5 com a lligand principal.
Els queratinòcits de l'estrat basal també expressen integrines ß1. La més estudiada és la α3ß1, que està localitzada als dominis basal i lateral i té com a lligands les diferents laminines, el col·lagen IV i la fibronectina. Altres integrines d'aquesta subfamília són la α2 i la α5, que reconeixen el col·lagen i la fibronectina respectivament.
2.3 La integrina α6ß4 està implicada
en l'adhesió, la polaritat i la forma dels queratinòcits
Com a constituent dels hemidesmosomes, la integrina α6ß4 té un paper crucial en l'adhesió dels queratinòcits a la membrana basal, adhesió que és compatible amb la proliferació. Com s'ha dit abans, el començament de la diferenciació comporta la desadhesió i l'emigració cap als estrats suprabasals. Aquesta desadhesió implica la desorganització dels hemidesmosomes i la internalització de la integrina α6ß4, d'acord amb les observacions d'epidermis in situ i en queratinòcits en cultiu. No és descartable, però, que α6ß4 faciliti o promogui l'emigració dels queratinòcits cap als estrats suprabasals (vegeu l'apartat 2.5)
Cal preguntar-se, doncs, quin paper té aquesta integrina en el balanç proliferació/diferenciació dels queratinòcits. La informació s'ha obtingut d'epidermis in situ de ratolins ß4-/- (ratolins transformats que no expressen aquesta subunitat de la integrina). Aquests ratolins presenten retalls més o menys extensos de pell descamada, d'acord amb la funció adhesiva de la integrina. Tant en el si de la pell descamada com de la pell no descamada, s'observen grups proliferatius de cèl·lules indiferenciades o "perles" que coexisteixen a nivell suprabasal amb queratinòcits en diferenciació. Finalment, la diferenciació no queda suprimida en ratolins que no expressen ß4. En contrast, no s'observa cap d'aquests trets fenotípics en ratolins nuls per a α3 i ß1.
Per tant, les perles representen grups clonals de queratinòcits que, tot i no ser a l'estrat basal, no es diferencien i continuen dividint-se. Això suggereix que la integrina a6ß4 pot fer de lligam entre la desadhesió i la diferenciació dels queratinòcits.
Com a hipòtesi per explicar aquest lligam, s'ha proposat que la integrina α6ß4 s'implica, a més de fer-ho en l'adhesió, en el manteniment de la polaritat i la forma dels queratinòcits basals. La seva forma prismàtica està molt ben definida, i la polaritat, molt ben establerta segons l'expressió de la integrina exclusivament en el domini basal de la membrana, domini pel qual s'adhereixen fortament. La manca de la integrina fa que els queratinòcits s'hi adhereixin més feblement, gràcies a les integrines ß1, molt més disperses. Un cop desadherits de la membrana basal, els queratinòcits perden l'aspecte prismàtic i formen les perles esmentades, ja que continuen expressant uns nivells de ß1 normals, que són integrines implicades en l'adhesió i la promoció de la proliferació.
2.4 Les cèl·lules mare dels queratinòcits tenen una
expressió elevada d'integrines ß1
L'estrat germinatiu de l'epidermis esdevé una font de queratinòcits, ja que és una zona de proliferació cel·lular. No obstant això, el comportament divisional no és uniforme. Experiments de clonogènesi assenyalen que en els queratinòcits basals hi ha com a mínim dues poblacions cel·lulars. Un tipus cel·lular dóna lloc a clons de moltes cèl·lules (2 x 104 cèl·lules en dues setmanes) mentre que l'altre tipus cel·lular dóna lloc a colònies molt més reduïdes que es diferencien durant aquest període de temps. El primer grup correspon a les cèl·lules mare, per definició cèl·lules amb una gran capacitat d'autorenovació, es podria dir d'autorenovació indefinida, mentre que el segon grup el constitueixen les anomenades cèl·lules de proliferació transitòria (transit amplifying cells), ja que tenen capacitat d'autorenovació limitada, és a dir, transitòria.
Per esbrinar els marcadors de les cèl·lules mare, a fi de diferenciar-les de les altres cèl·lules, s'han utilitzat anticossos fluorescents contra diferents proteïnes dels queratinòcits, en particular contra les integrines ß1, i posteriorment s'han classificat d'acord amb la intensitat de fluorescència mitjançant citometria de flux i tècniques anàlogues. Així, s'han trobat un 20% de cèl·lules amb una intensitat màxima, que a la vegada són capaces d'originar clons molt nombrosos. En definitiva, aquestes experiències demostren que les cèl·lules mare dels queratinòcits tenen una expressió elevada d'integrines ß1.
A partir d'aquests resultats, s'ha pogut dissenyar el patró de distribució de les cèl·lules mare en l'epidermis interfol·licular in situ. S'acumulen en nínxols situats a la punta de les papil·les dèrmiques o en el fons de les crestes epidèrmiques, segons la regió del cos, llocs en els que el derma adjacent és especialment ric en fibroblasts. Gràcies a aquest patró, també s'ha pogut demostrar, in situ, una freqüència alta de cèl·lules en fase S que coincideix amb els nínxols de cèl·lules mare. Per tant, in situ i en condicions normals, les cèl·lules mare, tot i ocupant uns nínxols concrets i encara que tenen una gran capacitat proliferativa, es divideixen de manera bastant infreqüent, quasi rarament. La proliferació intensa correspon a les cèl·lules de proliferació transitòria, que es divideixen molt ràpidament, però poques vegades (tres o quatre generacions). Així, els nínxols de cèl·lules mare es poden considerar reservoris cel·lulars, que esdevenen centres de proliferació intensa solament en cas de ferida o de qualsevol contingència mecànica que malmeti l'epidermis.
 |
Nínxols de les cèl·lules mare |
Les cèl·lules de proliferació transitòria representen solament el primer pas de l'evolució temporal de les cèl·lules mare epidèrmiques cap a la diferenciació. El segon pas és la inducció (commitment) de les cèl·lules de proliferació transitòria a la diferenciació. Aquests dos passos tenen lloc a l'estrat basal, de manera que les cèl·lules romanen adherides a la membrana basal. El tercer pas i definitiu és l'inici de la diferenciació, pas que comporta la desadhesió i la migració subsegüent cap als estrats suprabasals. Així doncs, les cèl·lules mare, les cèl·lules de proliferació transitòria i les cèl·lules basals postmitòtiques, aquestes darreres induïdes a la diferenciació, coexisteixen a l'estrat basal i constitueixen tres estadis evolutius. El quart, el queratinòcit en diferenciació terminal, se situa als estrats suprabasals.
 |
Queratinòcits en l'epidermis interfol·licular |
Molecularment i funcionalment aquests tres passos impliquen canvis, molt particularment pel que fa a les integrines. Malauradament, el rol específic de cada integrina, α6ß4 i ß1, és poc conegut; però a la pell humana de nounat s'han pogut avaluar les propietats adhesives dels tres tipus cel·lulars en assaigs en què s'utilitzen matrius riques en col·lagen I, col·lagen IV i laminina 5. S'ha conclòs que les cèl·lules mare i les cèl·lules de proliferació transitòria són altament adhesives i tenen una elevada expressió de les dues integrines funcionals, les primeres, i una expressió menor de ß1, les segones. Les cèl·lules basals postmitòtiques, que ja expressen marcadors de diferenciació com ara la K10 i la involucrina, retenen la capacitat adhesiva de les altres cèl·lules, ja que encara mostren una expressió important de ß1, tot i que l'expressió de α6ß4 disminueix. L'inici de la diferenciació implica una davallada dràstica de l'expressió de les integrines ß1, el desengalzament dels hemidesmosomes i la internalització de les integrines α6ß4 i, consegüentment, la desadhesió i migració posterior. Entre els inductors d'aquests esdeveniments, el factor de transcripció c-Myc és un dels més ben estudiats, ja que també s'implica en determinar els patrons de diferenciació per donar lloc a altres estructures epidèrmiques com ara els fol·licles pilosos o les glàndules sebàcies.
 |
Queratinòcits basals en l'epidermis interfol·licular |
2.5 La distribució espacial dels queratinòcits basals s'assoleix
gràcies a una motilitat cel·lular diferencial
Com s'ha dit, a l'epidermis interfol·licular, les cèl·lules mare ocupen nínxols que coincideixen amb indrets propers al derma. Concretament, a la pell del cos i del cuir cabellut, on l'epidermis és prima, els nínxols són a la punta de les papil·les dèrmiques, mentre que en les epidermis més gruixudes, és a dir a les plantes dels peus i als palmells de les mans, els nínxols ocupen les crestes epidèrmiques. Però en qualsevol cas, els nínxols de cèl·lules mare són zones discretes, separades entre si pels altres queratinòcits basals, majoritàriament per les cèl·lules de proliferació transitòria que ocupen una àrea contínua que s'estén per tot el teixit.
Per a distingir els dos tipus cel·lulars, s'han tenyit retalls sencers d'epidermis amb anticossos fluorescents contra la subunitat ß1 i contra el factor Ki67 (marcador de cèl·lules que tenen una proliferació alta). Així mateix, la tinció immunofluorescent contra la queratina 10 (K10) permet visualitzar les cèl·lules induïdes a punt de desadherir-se i d'iniciar la diferenciació. Els resultats, efectivament, demostren que en regions on la tinció contra ß1 és feble hi ha una proliferació intensa. Així mateix, la tinció contra K10 esdevé positiva en regions molt puntuals, ja que solament un 8% dels queratinòcits basals expressen aquesta queratina. Amb més o menys intensitat, en canvi, l'expressen tots els queratinòcits suprabasals d'una pell normal.
Les cèl·lules mare ocupen nínxols determinats i la coexistència amb les cèl·lules de proliferació transitòria, encara que temporal, és gairebé inevitable. No obstant això, com que de cada divisió de les cèl·lules mare una de les dues cèl·lules filles esdevé cèl·lula de proliferació transitòria, aquestes cèl·lules són segregades gradualment del nínxol. Així doncs, cada cèl·lula de proliferació transitòria ha de migrar lateralment del nínxol de cèl·lules mare d'on deriva. Això fa pensar que la motilitat és diferent en els dos tipus de queratinòcits, cèl·lules mare i cèl·lules de proliferació transitòria, i que aquestes darreres són més mòbils que les primeres.
Per demostrar-ho, es cultiven els dos tipus cel·lulars sobre col·lagen IV i s'observa que els clons procedents de les cèl·lules mare formen grups cel·lulars compactes (la meitat de cèl·lules estan en contacte entre si), mentre que els clons procedents de cèl·lules transitòries formen grups més dispersos (menys d'un 30% de contacte intercel·lular).
2.6 Les integrines dels queratinòcits s'acoblen a vies mitogèniques
de transducció de senyal
L'adhesió amb mediació d'integrines i la proliferació, potencial o efectiva, són fets que es donen concomitantment en cèl·lules de l'estrat basal, concretament en les cèl·lules mare i en les cèl·lules transitòries. Es lògic pensar, doncs, que aquestes integrines indueixen senyals mitogènics.
La integrina hemidesmosòmica α6ß4 promou la progressió del cicle cel·lular. Efectivament, queratinòcits basals sembrats sobre un substrat ric en laminina 5, lligand d'aquesta integrina, en presència de mitògens, superen la fase G1. Aquest comportament contrasta amb el que s'observa en presència d'altres substrats, ja que queratinòcits sembrats sobre una matriu rica en col·lagena I, lligand de les integrines α3ß1 i α2ß1, no entren en la fase S (ni en presència de concentracions elevades de mitògens) encara que sí que mostren un fenotip corresponent a una extensió cel·lular màxima.
La incorporació del nucleòtid 5'-bromo-2'-deoxiuridina (BrdU) i la seva localització posterior amb anticossos, constitueix un mètode per comprovar l'entrada dels queratinòcits a la fase S. En plaques de cultiu amb matrius enriquides amb un component determinat (laminina o col·lagen), s'hi diposita un medi definit suplementat amb BrdU i mitògens. Els queratinòcits s'incuben durant 22 h.
Aquest funcionalitat de α6ß4 implica que la integrina és capaç de transduir senyals que afecten la proliferació cel·lular. Com s'ha esmentat en l'apartat 2.1, aquesta integrina, un cop activa funcionalment, interactua directament amb la Shc, tal com demostren experiments d'immunoprecitpitació i de fusió amb la proteïna GST. Aquesta fosfoproteïna adaptadora té dos dominis d'unió a fosfotirosines d'altres molècules: un a l'extrem aminoterminal, el domini PTB, i l'altre a l'extrem carboxiterminal, un domini SH2. Els experiments esmentats demostren que tant l'un com l'altre serveixen per interactuar amb la integrina α6ß4. La cua citoplasmàtica de ß4, fosforilada per cinases com ara la PKCγ, és la que hi interactua. Per tant, la integrina és la responsable del reclutament de la Shc La tirosina Y-317 fosforilada de la Shc constitueix, com ja s'ha dit (apartat 2.1), un lloc de reconeixement de la proteïna adaptadora Grb2 pel domini SH2, que alhora recluta la proteïna bescanviadora de nucleòtids, mSOS, activadora de Ras i de Rac. Així doncs, quan els queratinòcits se sembren en un substrat ric amb lligands de α6ß4, l'activació de la Ras i de la Rac és possible, mediada per la integrina i per la Shc. És important que les cèl·lules estiguin fixades al substrat, ja que l'activació de Ras és molt menor en queratinòcits en suspensió, encara que se suplementi el cultiu amb anticossos antiintegrina activadors.
A la vegada, la Ras i la Rac actives són inductores de vies senyalitzadores que menen a l'activació de cinases que, ja dins el nucli, fosforilen substrats. Aquestes cinases són l'ERK, comuna a moltes vies mitogèniques, i la JNK. Efectivament, aquestes dues cinases s'activen sota les mateixes condicions esmentades abans, és a dir, en queratinòcits fixats en un substrat ric en laminina. D'aquesta manera, la α6ß4 indueix l'activació de l'ERK i la JNK.
Com que les formes actives de les dues cinases són formes fosforilades de la molècula, l'activació de l'ERK i de la JNK s'avalua en immunoprecipitats contra aquestes cinases, obtinguts d'extractes de queratinòcits en diferents condicions de cultiu. La doble banda característica de la forma fosforilada permet fer aquesta avaluació.
La introducció en cèl·lules de formes mutants dominants negatives permet esbrinar quines GTPases intervenen en l'activació d'aquestes dues cinases. Així, en la via activadora de l'ERK intervenen la Ras i la Rho, ja que els dominants negatius inhibeixen l'activació de l'ERK mediada per la α6ß4, mentre que dominants negatius de la Rac no tenen cap efecte. En la via activadora de la JNK, hi ha implicada la Rac1, però no la Rho.
Val a dir que en aquesta darrera via, la Rac1 està regulada indirectament per la Ras. Efectivament, en dominants negatius de la Ras o en presència de wortmanina, un inhibidor específic de la cinasa PI-3K, s'inhibeix l'activació de la JNK amb mediació de la α6ß4. Aquests resultats suggereixen que PI-3K és un esglaó intermedi entre Ras i Rac1.
L'ERK i la JNK actives promouen més o menys indirectament l'expressió de la ciclina D1, proteïna clau en la superació de la fase G1 del cicle cel·lular (vegeu el bloc VII).
D'aquesta manera, la integrina α6ß4 promou la proliferació, per dues vies senyalitzadores, quan els queratinòcits estan fixos sobre una matriu rica en laminina i en presència de mitògens. Per contra, aquests queratinòcits no superen la fase G1 quan la matriu és rica en col·lagen I, lligand de les integrines ß1.
No obstant això, les integrines ß1, en tant que marcadors de les cèl·lules mare, han de tenir un paper important en l'assoliment de les dues propietats d'aquestes cèl·lules: potencial proliferatiu i adhesivitat elevada. Així, l'expressió en queratinòcits humans de CD8ß1, una forma mutant dominant negativa de la integrina ß1, dóna lloc a una disminució de l'expressió de la ß1 endògena, a una disminució de l'adhesivitat i a una reducció de l'activitat de la MAP-cinasa. En definitiva, aquesta situació indueix una sortida del nínxol de les cèl·lules mare. No obstant això, el procés és reversible. Sobreexpressant la forma salvatge de la integrina ß1 en aquests queratinòcits, es restauren les característiques de cèl·lula mare.
La inducció de canvis semblants i amb la mateixa reversibilitat s'assoleix expressant en aquests queratinòcits la forma mutant dominant negativa de la MAP-cinasa-cinasa 1 (MAPKK1) i sobreexpressant-ne posteriorment la forma constitutivament activa.
2.7 En les ferides la síntesi, la secreció i el processament
de la laminina 5 regula la motilitat i l'adhesió dels queratinòcits
Tota ferida suposa una discontinuïtat del teixit i, com a resposta, se succeeixen canvis en el comportament dels queratinòcits basals propers a la ferida, pel que fa a la motilitat, l'adhesió i la proliferació. Aquests canvis van associats a reorganitzacions espaciotemporals del patró d'expressió de molècules d'adhesió; tot plegat dins la dinàmica normal de l'epidermis, no pas lligat a una dinàmica patològica.
L'epidermis ha de créixer per reparar la ferida. En aquesta epidermis en creixement la línia frontal està formada per queratinòcits migratoris situats en el si de la ferida, derivats de queratinòcits quiescents situats a l'epidermis adjacent a la ferida i que han adquirit el fenotip migratori. La base d'aquesta derivació és la composició de la matriu extracel·lular, en què la laminina 5, producte de secreció dels queratinòcits més distals del front d'avenç, té un paper preponderant. Aquests queratinòcits segreguen una forma precursora de la laminina 5, amb la cadena a3 no processada de 200 kDa, i es forma una matriu extracel·lular provisional enriquida en aquesta laminina, a part d'altres components com ara el col·lagen VII. Mitjançant la participació de la integrina α2ß1 es promou la migració sobre el col·lagen. La proteòlisi extracel·lular de la laminina 5 (α3 de 165 kDa) i la participació de les integrines α3ß1 i α6ß4 provoquen la formació d'estructures adhesives com ara unions gap i hemidesmosomes en les cèl·lules quiescents. També es frena la migració, i la forma processada de la laminina 5 és justament un del factors responsables d'aquesta frenada.
 |
Queratinòcits basals a prop d'una ferida |
Més concretament, vuit hores després de la ferida, els queratinòcits més distals del front d'avenç expressen i segreguen laminina 5 en la forma precursora, en detriment d'altres components de matriu extracel·lular com ara col·lagen VII o proteoglicà de sulfat d'heparà. Aquesta forma precursora té tres cadenes α3, ß3, i γ2, la més gran de les quals és la α3, que té cinc subdominis G1-G5 carboxiterminals. Una proteasa extracel·lular, com ara la plasmina, talla aquesta cadena en un punt situat entre els subdominis G3 i G4 i queda la forma madura de la laminina amb només tres subdominis G a la cadena α3. Aquest processament inhibeix de manera dràstica la migració dels queratinòcits, tal vegada a causa d'un canvi d'especificitat i/o afinitat per les integrines, o perquè aquesta forma processada impedeix una integració correcta de la laminina a la matriu extracel·lular.
D'acord amb tot això, anticossos monoclonals com ara C2-5, que reconeixen tant la forma precursora com la forma madura de la laminina, detecten la molècula tant a la zona de la ferida com a la làmina basal fora de la ferida. Per contra, un anticòs monoclonal com ara D2-1, que reconeix un epítop situat entre G4 i G5, només detecta laminina a la zona de la ferida.
Els queratinòcits migren sobre el col·lagen amb la cooperació de la laminina 5. Encara que no és clar el grau de cooperació, sembla que la laminina és un factor limitant per a la migració, ja que queratinòcits de ratolins genoanul·lats (knockout) per a la laminina 5 sembrats sobre col·lagen presenten una migració molt reduïda respecte als queratinòcits de ratolins normals. Les integrines ß1 també són limitants per a la migració i el tancament de la ferida, ja que en cultius confluents de queratinòcits on s'ha practicat una incisió amb llevament de cèl·lules, el tractament amb anticossos contra ß1 impedeix el tancament de la incisió. La interacció dels queratinòcits migratoris amb el col·lagen, mediada per la integrina α2ß1, depèn de Rho, ja que els queratinòcits del front d'avenç d'un explant de pell en cultiu frenen la motilitat i s'arrodoneixen en presència de la toxina B, un agent inhibidor de Rho.
A la zona de la ferida adjacent a la línia frontal, la integrina α3ß1 fa de mediadora en l'adhesió dels queratinòcits i la laminina 5. Aquesta interacció és suficient per provocar la formació de comunicacions intercel·lulars en forma d'unions de tipus gap, com ho demostra l'augment de l'expressió de la connexina 43, proteïna component d'aquestes unions. Aquesta comunicació ajuda a integrar cèl·lules individualitzades en colònies sincronitzades.
La microinjecció d'un colorant fluorescent en queratinòcits de la línia frontal i en queratinòcits adjacents, permet comprovar que aquestes comunicacions existeixen en aquests darrers, però no en els primers. En els queratinòcits adjacents al cap de 5 o 10 minuts de la microinjecció s'observa transferència del colorant a altres cèl·lules veïnes. En canvi, en la línia frontal, passats aquests minuts, el colorant roman dins de les cèl·lules en què ha estat microinjectat.
Els queratinòcits més distals respecte a la ferida, s'adhereixen a la laminina 5 mitjançant hemidesmosomes, dels quals la integrina α6ß4 és la mediadora. No solament la integrina i el lligand són responsables de l'adhesió dels queratinòcits, sinó que també afavoreixen la supervivència i la progressió del cicle cel·lular. Efectivament, d'una banda, queratinòcits nuls en laminina 5, a més de tenir una motilitat reduïda, no sobreviuen en cultiu. D'altra banda, ratolins mutants en ß4 mostren signes d'apoptosi en epitelis i, a més, defectes proliferatius caracteritzats per un increment dels nivells de p27, inhibidor de la CDK (vegeu el bloc 6, apartat 5.2). Així doncs, un increment gradual de l'expressió de α6ß4 en direcció a l'epidermis fa que a l'epidermis propera a la ferida es passi d'una zona de queratinòcits quiescents a una zona de proliferació pròpia de l'estrat basal de l'epidermis. Com que els hemidesmosomes no es desengalzen durant la mitosi, l'adhesió dels queratinòcits basals proporciona un avantatge competitiu assegurant que cèl·lules amb un alt potencial proliferatiu romanguin a l'estrat basal. Aquest potencial proliferatiu és decisiu, ja que al cap i a la fi la proliferació cel·lular esdevé la causa última del tancament de la ferida.
3. Les integrines en el sistema nerviós
Les cèl·lules del sistema nerviós, particularment les neurones, són altament sociables. Per assolir la capacitat funcional plena, les neurones joves han de migrar, recorrent a vegades grans distàncies, i establir contactes amb altres cèl·lules per teixir la xarxa, normalment complexa, dels circuits neuronals. Per això, les neurones expressen tota una colla de molècules d'adhesió cel·lular (CAM) que fan de mediadores en les interaccions cèl·lula-cèl·lula i cèl·lula-matriu, i que inclouen receptors de la família de les immunoglobulines, a més de cadherines i integrines. Aquestes darreres s'han revelat especialment interessants pel que fa al desenvolupament del sistema nerviós, a part de ser-ho per la intervenció en altres processos en el si del sistema nerviós adult com ara l'estabilització de la barrera hematoencefàlica o les malalties neuronals.
3.1 Les integrines intervenen en el desenvolupament del sistema nerviós
central. La corticogènesi com a exemple.
En el sistema nerviós central les integrines ß1 i αv s'expressen de forma generalitzada en diferents tipus cel·lulars com ara neurones, cèl·lules glials, cèl·lules meníngies i cèl·lules endotelials. Aquesta expressió es regula de forma regional i en el desenvolupament. Típiques de leucòcits, les integrines ß2 també s'expressen en el sistema nerviós central, en les cèl·lules de la micròglia i en els leucòcits infiltrats.
Durant el desenvolupament és freqüent que el lloc on s'originen les neurones i el lloc on s'estableixen siguin diferents, per la qual cosa la migració cel·lular és la norma general. En l'escorça cerebral la migració generalment és radial, des de la zona ventricular, on es dóna la proliferació cel·lular, fins a la placa cortical, situada per sota de la zona marginal. És a dir, quan surten del cicle cel·lular, els neuroblasts s'uneixen a fibres columnars de naturalesa glial que s'estenen radialment fins a la làmina basal associada a les cèl·lules meníngies (glia radial) i migren fins a establir-se a la placa cortical. Aquí, després de desenganxar-se de les fibres, es distribueixen en capes cel·lulars i configuren l'estructura laminar típica de la placa. Característicament, les cèl·lules més joves ocupen posicions més superficials.
Diferents estudis primerencs han suggerit que les integrines ß1 tenen un paper important en aquesta migració i adhesió cel·lulars. La inhibició de la integrina α3ß1 mitjançant anticossos causa una reducció en la migració in vitro al llarg de la glia. També s'observa una reducció en la migració in vivo després de la introducció d'un mRNA antisentit de ß1 o de α6.
Alguns estudis recents, no obstant això, inviten a fer una revisió del paper de les integrines en la corticogènesi i conferir a la zona marginal i a la làmina basal un paper més important del que es creia. La zona marginal és un estrat cel·lular, format per les cèl·lules de Cajal-Retzius que fabriquen un component de matriu extracelul·lar, la reelina, glicoproteïna de 400 kDa que pot actuar de lligand de la integrina α3ß1 i d'altres receptors.
La utilització de mutants en sistemes in vivo i in vitro ha ajudat a esbrinar les funcions de la reelina. Els ratolins anomenats reeler no expressen reelina, ja que les cèl·lules de Cajal-Retzius són incapaces de sintetitzar-la o de segregar-la. En assaigs d'agregació cel·lular es demostra que neurones procedents d'aquests ratolins presenten un increment en l'adhesió. En cultius de neurones normals la utilització d'anticossos CR-50, que bloquegen la reelina, també indueix a la formació d'agregats.
Aquests resultats suggereixen que la reelina inhibeix l'adhesió. Els talls histològics de l'escorça en desenvolupament de ratolins reeler mostren una absència de laminació i una distribució obliqua de les neurones, a més d'invertida, en què els neuroblasts més vells toquen la làmina basal.
Per esbrinar si la integrina α3ß1 fa de mediadora en la formació de la reelina i saber-ne la funció plausible, s'han obtingut ratolins mutants híbrids segons la tècnica Cre-lox.
S'encreuen ratolins transgènics que expressen la recombinasa Cre sota el control del promotor de la nestina amb ratolins transgènics que expressen l'al·lel ß1 flanquejat per dos llocs LoxP. En els ratolins híbrids, les cèl·lules que expressen la nestina, és a dir les neurones i les cèl·lules glials, no expressen la subunitat ß1, mentre que les altres cèl·lules, que no expressen la nestina, sí que expressen la subunitat de la integrina. És una tècnica que permet obtenir ratolins viables defectius en ß1 només en certs tipus cel·lulars. Els ratolins mutants ß1-/- no són viables.
El fenotip d'aquests ratolins híbrids amb deficiència de ß1, mostra una reducció de mida del cervell i la fusió dels hemisferis corticals. El còrtex cerebral es presenta fortament convolut. Les proves immunocitoquímics demostren una degradació de les proteïnes de la làmina basal. Els talls histològics mostren una laminació, com els ratolins salvatges, així com la mateixa distribució, és a dir, neuroblasts joves que toquen la zona marginal. La novetat que presenten aquests talls és que la làmina basal apareix discontínua i al mateix temps hi ha nombrosos indrets de la zona marginal en què les cèl·lules de Cajal-Retzius formen grups heterotípics amb neuroblasts que han envaït la zona. A més les fibres glials no arriben a la làmina basal.
Tot plegat fa pensar que la integrina ß1 no intervé en el control de la migració neuronal, ja que en els ratolins deficients en aquesta subunitat els neuroblasts ocupen una posició correcta. Però sí que pot intervenir en l'organització de la làmina basal i també, potser, en la configuració de l'estrat de cèl·lules de Cajal-Retzius de la zona marginal. La reelina, per contra, sí que hi intervindria, com a modulador negatiu.
3.2 Les integrines intervenen en el desenvolupament del sistema nerviós
perifèric. La gangliogènesi com a exemple
Les unitats funcionals del sistema nerviós perifèric són les fibres nervioses, formades per axons i fibres de Schwann. Aquestes darreres presenten una polaritat molt definida que els permet interactuar amb els axons, polaritat que implica una distribució de les integrines, de complexos integrina-lligand, de components citosquelètics i de molècules senyalitzadores. Les neurones experimenten una migració per situar-se en els futurs ganglis i una expansió cel·lular en què les neurites creixen cap a les seves dianes, acompanyades per les cèl·lules de Schwann si són futurs axons. Les neurites creixen com a resposta a senyals, entre les quals n'hi ha d'atractives (p. e., netrines) i de repel·lents (p. e., semaforines), que són captades pels filopodis o lamel·lipodis. Altres senyals són factors solubles, com ara el factor de creixement neuronal NGF o molècules d'adhesió com ara l'N-CAM, l'N-cadherina, l'L1 i les integrines.
El lloc de proliferació cel·lular és la cresta neural, on hi ha una població mixta de cèl·lules pluripotencials en diversos estadis de diferenciació. Alguns estudis recents han demostrat que els precursors de les cèl·lules de Schwann es determinen per a la diferenciació gràcies a la interacció amb axons neuronals, i també amb productes de secreció solubles d'aquests axons, com ara les neuregulines. Per embolcallar els feixos de fibres nervioses i formar els nervis, les cèl·lules precursores del perineuri, d'origen mesenquimàtic, formen uns fascicles perifèrics on s'arrengleren en làmines, on contacten entre si mitjançant unions íntimes, i fabriquen una làmina basal.
La sortida del cicle cel·lular i la determinació a la diferenciació comporta un canvi en l'expressió de les integrines. Així, la integrina α1ß1 s'expressa en cèl·lules de la cresta neural en fase proliferativa. Aquesta integrina interactua amb la proteïna reguladora Shc, component de la via de senyalització mitogènica. En les cèl·lules de Schwann, la diferenciació porta a la substitució de α1ß1 per α6ß1, integrina que s'expressa en cèl·lules que han sortit del cicle cel·lular i que, per tant, les cèl·lules precursores determinades a la diferenciació ja expressen.
Les neurones de la cresta neural presenten un fenotip migrador ja des de la determinació a la diferenciació. Per tant, aquesta migració estarà modulada per tot un conjunt de components de matriu extracel·lular, lligands potencials de diverses integrines. Així, la majoria d'aquests components afavoriran la migració (components permissius) com ara agrecans, perlecans o versicans. La quantitat relativa d'ambdós tipus de components regirà aquesta modulació. La migració neuronal que porta a la formació dels ganglis o gangliogènesi, té lloc en el si d'un escleròtom de la cresta neural, on les cèl·lules van des de la cresta neural fins al centre de l'escleròtom. Després de la migració, la maduració definitiva del gangli implica una agregació cel·lular. Durant tot aquest procés de desenvolupament, té lloc una remodelació espaciotemporal dels components de la matriu extracel·lular de la cresta neural. Així, en la fase de migració cel·lular, la matriu extracel·lular és rica en fibronectines, col·làgens I i II i versicans; i en la fase d'agregació la matriu està dominada per laminines, col·lagen IV, tenascina i perlecans.
Enfront d'aquesta remodelació de la matriu, és clar que hi ha un canvi d'expressió d'integrines. Entre totes les integrines implicades en el procés migració-agregació, es pot dir que la integrina αvß1 va sempre lligada a la migració, mentre que la α4ß1 s'expressa en cèl·lules en fase d'agregació.
Quan s'empelta en el lloc d'un gangli d'un embrió de ratolí cèl·lules S180 transfectades de forma estable i que expressen α4ß1 en nivells baixos, comencen a migrar, mentre que les cèl·lules de l'hoste romanen agregades.
La migració de les cèl·lules de Schwann té la mediació d'integrines de la família ß1, com ara les α2 i α6, i la laminina-1, la laminina-2 i la fibronectina són els components de la matriu implicats. Els axons o els feixos d'axons que seran embolcallats, són decisius per a aquesta migració.
3.3 La matriu extracel·lular i les integrines modulen la velocitat
i la direcció del creixement d'axons i dendrites
Per contactar amb altres cèl·lules, les neurones experimenten una expansió en forma de projeccions citoplasmàtiques o neurites. La punta d'aquestes neurites, o con de creixement neurític, emet filopodis i lamel·lipodis que interactuen amb el substrat sense formar veritables contactes focals.
Encara que la influència que tenen les interaccions integrina-matriu ha estat molt estudiada en sistemes in vitro, hi ha molts menys resultats in vivo. En ambdós tipus d'estudis moltes vegades hi ha concordança de resultats: el bloqueig de les integrines o l'alteració de la matriu provoca un col·lapse de l'expansió d'axons i dendrites. Altres vegades, però, el que s'observa in vivo (per exemple, un creixement i direccionament normals en ratolins nuls per a una integrina determinada) no concorda amb els experiments in vitro. Això suggereix que aquest comportament és un fenomen multifactorial en que intervenen diversos receptors i diversos lligands.
La influència de la matriu extracel·lular és molt diversa. A més de la composició, la concentració dels components també és important, a fi de que l'expansió cel·lular tingui una velocitat apropiada. S'ha comprovat que això és possible a partir de l'expressió posttraduccional de les integrines a la superfície cel·lular. Concretament, enfront d'una davallada de concentració de laminina hi ha un increment d'integrina α6ß1 a la superfície cel·lular, i viceversa.
En una altra classe d'experiments, s'ha vist que la matriu pot modificar totalment la influència d'altres senyals, modificació mediada per la integrina. Les neurones retinals de Xenopus cultivades sobre vidre, fibronectina i polilisina, en presència de netrina-1, s'estenen atretes per aquest factor. Quan es cultiven sobre laminina-1, la netrina esdevé un factor repulsiu, de manera que les extensions de les neurones s'allunyen del focus de netrina. Aquest canvi en la resposta no es dóna quan es bloquegen les integrines ß1 mitjançant anticossos. Plausiblement, la integrina α6ß1 fa de coreceptor amb una molècula de 67 kDa que reconeix la laminina, i fa davallar els nivells d'AMPc al con de creixement, nivells necessaris per a la resposta a la netrina-1. Per tant, la laminina-1 i la netrina-1 cooperen de forma antagònica per reconduir l'expansió del con de creixement.
3.4 En el sistema nerviós adult les integrines intervenen en la modulació
de la plasticitat sinàptica
En la biologia de les sinapsis, les integrines hi tenen un paper important, ja que no constitueixen un cas particular d'interacció cèl·lula-matriu extracel·lular. Les integrines de la familia ß1 es localitzen a les sinapsis, concretament la α8 a les membranes postsinàptiques de neurones d'hipocamp adult. La α7 està sintetitzada per les fibres musculars i es localitza a les unions neuromusculars. En aquestes unions, també s'hi localitza la αv, que és receptora de l'agrina, proteïna de matriu extracel·lular específica d'aquest indret. En l'establiment d'aquestes unions es dóna una agrupació de receptors de l'acetilcolina, que és inhibida quan es bloqueja la integrina α7ß1 amb anticossos.
Nombrosos estudis recents han demostrat que el bloqueig de diferents integrines afecta de manera clara la plasticitat de les sinapsis adultes, imprescindible per a funcions com ara l'aprenentatge i la memòria. L'hipocamp, regió de l'escorça cerebral situada a la zona temporal, és la part del cervell implicada en la memòria retentiva, és a dir, a curt termini, en que el funcionament de les sinapsis és decisiu.
Aquesta funció de l'hipocamp és possible gràcies a la inducció i al manteniment posterior del que s'anomena potenciació a llarg termini (LTP) que és pot definir com un increment persistent del potencial sinàptic, gràcies a la capacitació de les neurones per transmetre estímuls amb més facilitat, com a conseqüència de transmissions anteriors. Constitueix la base d'una mena de memòria cel·lular. L'aplicació de microelèctrodes a talls d'hipocamp in vitro permet fer una valoració quantitativa de l'LTP.
L'aplicació de pèptids inhibidors de la interacció integrina-matriu a preparacions in vitro de llesques d'hipocamp, en diferents temps, demostren un decrement en l'LTP quan l'aplicació es fa durant els 25 minuts posteriors a la inducció, i passat aquest temps no hi ha cap efecte. Això suggereix que les integrines tenen un paper important en l'estabilització de l'LTP, però no pas en la inducció. Les integrines implicades són de la familia ß3: ratolins genoanul·lats (knock-out) per a aquesta subunitat, que són viables i fèrtils, presenten dèficits en la conformació de l'aprenentatge i la memòria.
La proteïna associada a integrines IAP/CD47 té una expressió important en sinapsis de l'hipocamp, i ratolins deficients en aquesta proteïna presenten una reducció significativa de l'LTP. Es pot dir el mateix de ratolins deficients en la proteïna tirosina-cinasa Fyn.
BIBLIOGRAFIA
La Pell:
FUCHS, E. et al. 1997. Integrators of epidermal growth and differentiation:
distinc functions for ß1 and ß4 integrins.
Current Opinion in Genetics & Development, 672-682
WATT, F.M. 2001. Stem cell fate and patterning in mammalian epidermis
Current Opinion in Genetics & Development, 11:410-417
Sistema nerviós:
MILNER R. & CAMPBELL, I. 2002. The integrin family of cell adhesion
molecules has multiple functions within the CNS
Journal of Neuroscience Research 69: 286-291.
Fonts de referència terminològica